Влияние мобильной фазы Ph на разделение ионизируемых соединений в хроматографии

PK_a ионизируемой группы — это pH, при котором половина молекул находится в ионизированной форме, а половина — нейтральна.Уравнение Хендерсона — Хассельбальха описывает это равновесие:

pH = pK_a + log[[A−]/[HA]] для кислоты

pH = pK_a + log[[B]/[BH+]] для базы

Когда рН подвижной фазы составляет две единицы ниже рК_a кислоты, более 99% молекул находятся в нейтральной (HA) форме. И наоборот, две единицы выше рК_a приводят к >99% ионизированной (A−) форме. Для оснований применяется обратное. Этот бинарный переключатель между заряженными и незаряженными состояниями приводит к драматическим изменениям хроматографического удержания, наблюдаемого с изменением рН.

Как pH влияет на удержание в реверсивной хроматографии

Нейтральный против ионизированных видов

В реверсивной фазовой хроматографии стационарная фаза гидрофобна (обычно C18). Нейтральная, неполярная аналитная перегородка сильно встает в стационарную фазу, что приводит к более длительному времени удержания. Ионизированные виды более полярны и гидрофильны; они предпочитают подвижную фазу и элюировать раньше. Поэтому коэффициент удержания (k) высокочувствителен к pH, когда аналит ионизируем. Соединение, которое полностью нейтрально при pH 4, может иметь k из 10, в то время как при pH 7 оно может быть частично ионизировано и иметь k из 2. Эта чувствительность может быть использована для достижения селективности, но также требует тщательного контроля pH для обеспечения воспроизводимости.

Манипуляции селективностью

При регулировке pH аналитики могут избирательно усиливать или подавлять ионизацию специфических аналитов в смеси. Рассмотрим образец, содержащий кислоту (pK_]a4.8) и основание (pKa8.2). При pH 3 кислота нейтральна (сохраняется) и основание полностью протонировано (полярное, менее удерживаемое). При pH 7 кислота частично ионизирована и основание нейтрально — порядок удержания может изменяться. Эта pH-зависимая селективность является мощным инструментом для разработки метода, особенно при работе со сложными смесями фармацевтических соединений или метаболитов.

Пик формы и хвост

Ионизируемые соединения часто производят плохие пиковые формы, когда рН мобильной фазы не оптимизирован. Частично ионизированные аналиты существуют в двух формах, которые медленно переключаются в хроматографической временной шкале, что приводит к широким хвостовым пикам. Работая при рН, по крайней мере, от одного до двух единиц от рК_а, гарантирует, что >90% аналита находится в одном ионизирующем состоянии, резко улучшая пиковую симметрию. Буферные мобильные фазы необходимы для поддержания постоянного рН и предотвращения локальных градиентов рН, которые вызывают пиковое искажение.

Буферный выбор и стабильность pH

Общие буферы для LC

Выбор буфера с достаточной емкостью в пределах желаемого диапазона pH имеет решающее значение. Фосфатные буферы широко используются для pH 2-3 и 6-8, но они не являются летучими и могут быть несовместимы с масс-спектрометрией. Форматные (pH 3-4) и ацетатные (pH 4-5) буферы являются летучими и MS-дружественными. Бикарбонат аммония (pH 7-9) полезен для разделения с высоким pH. Для крайних значений pH может использоваться перхлорная кислота (низкий pH) или гидроксид аммония (высокий pH), но следует учитывать стабильность колонки. Современные гибридные колонки кремнезема (например, BEH, HSS) переносят pH 1-12, расширяя полезное окно pH.

Достижение воспроизводимости

Концентрация буфера должна составлять не менее 10-50 мМ для обеспечения согласованной ионной прочности и контроля pH. Даже при использовании буфера колебания температуры могут сдвигать pH (обычно -0,01 до -0,03 pH единиц на °C). Используйте колоночную печь для поддержания температуры в пределах ±0,5 °C. Кроме того, дегальные мобильные фазы, чтобы избежать поглощения углекислого газа, что снижает pH с течением времени.

Мобильный фазовый pH vs. водный pH

При добавлении органических модификаторов (например, ацетонитрила, метанола) эффективный pH в гидроорганической смеси может отличаться от водного буферного pH. pH подвижной фазы следует измерять после смешивания или, по меньшей мере, буферный pH следует регулировать с учетом эффекта растворителя. Многие хроматографы готовят водный буфер при pH 0,2-0,3 единицы более кислой или базовой для компенсации, на основе эмпирического тестирования.

Стратегии практического развития методов

Скаутинг pH градиентов

Общий подход к разработке метода заключается в запуске градиента pH-скаутирования: многократно впрыскивайте образец с мобильными фазами при pH 2,5, 4.0, 6.0, 8.0 и 9.5. Наблюдая за изменениями удержания и пиковыми формами, можно быстро идентифицировать оптимальный pH. Программные инструменты, такие как DryLab или ChromSword, могут автоматизировать этот процесс и прогнозировать удержание при любом pH с использованием данных pK_a.

Использование pK_a Инструменты прогнозирования

Если экспериментальные значения pK_a неизвестны, то вычислительное предсказание доступно через программное обеспечение, такое как ACD/Labs или MarvinSketch. Эти инструменты оценивают pK_a с разумной точностью (±0,5 единиц). Для разработки метода, начиная с pH, который находится на два единицы ниже самого сильного предсказанного pK_aa (для кислот) или на два единицы выше (для оснований), является безопасным первым предположением.

Тематическое исследование: разделение смеси слабых кислот и оснований

Рассмотрим смесь, содержащую слабую кислоту (pK_a4,5) и слабое основание (pK_a6,5). При pH 3.0 кислота нейтральна и удерживается; основание полностью протонировано и элюирует на ранней стадии. При pH 5,5 оба соединения частично ионизированы и могут коэлюировать. При pH 8,0 кислота полностью ионизирована (раннее элюирование) и основание нейтрально (сохраняется). Таким образом, либо кислотные, либо основные условия могут обеспечить базовое разделение, в то время как средний pH обеспечивает плохую селективность. Выбор зависит от других компонентов образца и требований к обнаружению.

За пределами обратной фазы: Хилик и Ион-обмен

Гидрофильная интеракционная жидкостная хроматография (HILIC)

В HILIC стационарная фаза является полярной (например, кремнезем, амид, цвиттерионный) и удержание приводится в движение путем разделения на богатый водой слой. Ионизируемые соединения проявляют противоположное поведение удержания по сравнению с обратной фазой: заряженные виды более удерживаются в HILIC, потому что они более гидрофильны и сильно взаимодействуют с полярной стационарной фазой. Поэтому при низком pH основные соединения (положительно заряженные) будут иметь высокую удержание; при высоком pH кислые соединения (отрицательно заряженные) будут сохранены. pH оптимизация в HILIC одинаково важна и должна учитывать как pK аналита _a , так и химию колонки.

Ионно-обменная хроматография

В ионообменной хроматографии рН контролирует заряд как на стационарной фазе, так и на аналите. Для сильного катионного обмена (SCX) стационарная фаза представляет собой сульфоновую кислоту, которая всегда отрицательно заряжена; удержание увеличивается для положительно заряженных аналитов. Коррекция рН для полного протонирования основных аналитов максимизирует удержание. Для слабого анионного обмена (WAX) стационарная фаза содержит слабое основание; ее состояние заряда изменяется с рН. Здесь pH должен быть выбран для сохранения положительно заряженной стационарной фазы и отрицательно заряженного аналита для удержания. Понимание перекрытия значений pK_a имеет важное значение.

Температура, ионная сила и растворитель

Зависимость от температуры

Температура не только изменяет вязкость и диффузию, но и сдвигает значения pK_a (обычно -0,02 - -0,04 pK_aa единиц на °C для большинства кислот и оснований.a Более высокие температуры ускоряют перенос протона и могут улучшить пиковую форму за счет уменьшения кинетического вклада в расширение полосы. Однако изменения температуры, которые изменяют pH мобильной фазы, могут привести к сдвигам в удержании. Всегда используйте термостатированную колоночную печь и учитывайте комбинированное влияние pH и температуры на селективность.

Ионическая сила

Концентрация буферных солей (ионная прочность) влияет на коэффициенты активности заряженных видов, тем самым слегка сдвигая эффективную pK_a. Более высокая ионная прочность может экранировать электростатические взаимодействия с остатками силанол на стационарной фазе, уменьшая хвостохранилище для основных соединений. Однако очень высокие концентрации соли могут вызывать осадки или засорение колонн, особенно с высоким органическим содержанием. Типичная отправная точка — буфер 20 мМ.

Влияние органических модификаторов

Ацетонитрил и метанол могут изменять кажущуюся pK_a аналитов, изменяя свойства диэлектрической постоянной и сольватации.Как правило, добавление органического растворителя уменьшает pK_aa_{a] оснований, сужая диапазон pH, в котором соединение остается нейтральным. Этот эффект особенно примечателен в градиентных методах, где органический процент изменяется. Для критических разделений целесообразно измерять удержание в нескольких органических процентах с постоянным pH, чтобы понять, как изменяется равновесие ионизации.}

Расширенные темы: со-ионные эффекты и фазы смешанного режима

Co-Ion и контр-Ion эффекты

В ионопарной хроматографии добавление контр-иона (например, TFA, гептафторбутировой кислоты или триэтиламина) может образовывать ионные пары с заряженными аналитами, эффективно маскируя заряд и увеличивая удержание. pH по-прежнему контролирует состояние заряда аналита и ион-парного реагента. Например, при pH 2 TFA полностью депротонируется (TFA-) и пары с протонированными основаниями, увеличивая удержание. При pH 7 TFA все еще ионизируется, но основание может быть нейтральным, уменьшая ион-парирование. Оптимизация концентрации как pH, так и ион-парного реагента является мощной, но сложной стратегией.

Смешанные стационарные фазы

Смешанные колонны сочетают обратную фазу с функциональностью ионообмена (например, C18 + слабый анионный обмен). Эти фазы обеспечивают ортогональную селективность и могут быть настроены по pH. При низком pH группы анионного обмена протонируются и сохраняют отрицательно заряженные аналиты; при высоком pH они нейтральны и происходит только обратное удержание фазы. Такие колонки становятся все более популярными для разделения высокополярных ионизируемых соединений, которые плохо удерживаются на обычной обратной фазе.

Выпады и устранение неполадок

Невоспроизводимое удержание

Если время удержания дрейфует между пробегами, подозреваемая нестабильность рН. Проверьте, что буфер свежий, электрод рН откалиброван, а подвижная фаза подготовлена правильно. Также проверьте, что колонка полностью уравновешена (10-20 объемов колонки) после изменения рН. Взаимодействие силанола с основными соединениями может вызывать постепенные изменения удержания по мере старения колонки; рассмотрите возможность использования выделенной колонки с низким рН или высоким рН, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

Пик, разделяющий или плечо

Если пик кажется разделенным или имеет плечо, подвижная фаза pH, вероятно, находится вблизи pK_a аналита, вызывая медленную интерконверсию между двумя формами. Настройте pH по меньшей мере на 1,5 единицы от pK_a. Альтернативно, повышайте температуру для ускорения кинетики, но изменение pH обычно более эффективно.

Буферные осадки

Фосфатные буферы могут осаждаться органическим растворителем в высоких концентрациях. Всегда смешивать буфер и органический в конечном соотношении перед использованием и избегать чрезмерно высоких концентраций соли (≥100 мМ). Использование летучих буферов (формат, ацетат) снижает этот риск.

Заключение