Влияние состава мобильной фазы на разрешение в обратной фазе Hplc

Введение в HPLC обратной фазы и роль мобильной фазы

Обратно-фазная высокопроизводительная жидкостная хроматография (RP-HPLC) остается одной из самых универсальных и широко распространенных методов разделения в фармацевтических, экологических, биохимических и пищевых лабораториях анализа. Метод опирается на неполярную стационарную фазу - обычно C18, C8 или фенилсвязанный диоксид кремния - и полярную водно-органическую подвижную фазу. Удержание и разделение возникают из гидрофобных взаимодействий между аналитами и стационарной фазой; чем более гидрофобное соединение, тем дольше оно сохраняется.

В то время как стационарная фазовая химия и размеры колонок фиксируются во время разработки метода, подвижная фазовая композиция обеспечивает наибольшую гибкость для настройки разделения. Небольшие корректировки в органическом типе растворителя, соотношении органического к воде, рН буфера, ионной прочности или добавлении модификаторов могут глубоко изменить время удержания, пиковое расстояние и общее разрешение. Освоение этих переменных имеет важное значение для достижения базового разделения близкородственных соединений, улучшения пределов обнаружения и сокращения времени анализа.

Теоретические основы разрешения в РП-ГПЛК

Разрешение (R_]s) между двумя смежными пиками определяется фундаментальным уравнением:

R_s = (√N/4) × (α — 1) × (k'/(1 + k'))

где N - эффективность колонки (номер пластины), α - коэффициент селективности между двумя анализируемыми, а k' - коэффициент удержания (фактор емкости) пика, выходящего позже.

• Эффективность (N): Хотя в основном определяется качеством колонки и скоростью потока, вязкость подвижной фазы и концентрация добавки могут влиять на перенос массы и, следовательно, высоту пластины.
• Селективность (α): Соотношение факторов удержания для двух соединений высокочувствительно к подвижной фазовой композиции, особенно к типу органического растворителя и рН. Изменение органического растворителя от ацетонитрила до метанола может изменить порядок элюирования для определенных пар.
• Коэффициент удержания (k'): Процент органического растворителя контролирует общую прочность элюирования. Более высокое органическое содержание снижает k' для всех аналитов, сжимая хроматограмму.

Тщательное понимание того, как каждый компонент мобильной фазы влияет на эти параметры, позволяет аналитику систематически оптимизировать разделение, а не полагаться на догадки.

Ключевые компоненты мобильной фазы

Вода и водные буферы

Вода является слабым растворителем в RP-HPLC. Вода высокой чистоты (тип I, удельное сопротивление ≥ 18,2 MΩ·cm) является обязательной для предотвращения исходного шума, пиков призрака и загрязнения колонн. Для ионизируемых аналитов добавляются буферы для контроля рН. Общие буферы включают фосфат, ацетат, формиат и трифторуксусную кислоту (TFA) в концентрациях между 10 мМ и 50 мМ. Буфер должен быть совместим с детектором (например, низкая поглощаемость ультрафиолета на длине волны обнаружения) и растворим в органической водной смеси.

Органические растворители

Три наиболее распространенных органических модификатора - ацетонитрил (ACN), метанол (MeOH) и тетрагидрофуран (THF). Каждый из них имеет различные свойства:

• Ацетонитрил: Низкая вязкость, высокая элюотропная прочность, низкий УФ-отсечение (190 нм.) Отлично подходит для разделения, требующего высокой эффективности и быстрого анализа. ACN является выбором по умолчанию для многих методов.
• Метанол: Более высокая вязкость, чем ACN, что может увеличить обратное давление. Обеспечивает различную селективность, особенно для полярных соединений. Часто используется, когда ACN не удается разрешить критические пары.
• THF: Ещё более сильный элюент, но его использование ограничено высокой поглощающей способностью ультрафиолета (вырез ~ 212 нм) и потенциальными проблемами стабильности. Иногда используется для очень гидрофобных растворителей или для резкого изменения селективности.

Тернарные смеси воды, ACN и MeOH иногда используются для точной настройки селективности, хотя бинарные смеси более распространены для надежности.

Добавки и ионно-парные реагенты

Для заряженных аналитов (например, карбоновых кислот, аминов, пептидов) необходимо контролировать подвижный фазовый pH для обеспечения согласованных состояний ионизации. Ионно-парные реагенты, такие как гептафторбутировая кислота (HFBA) или триэтиламмонийфосфат, могут быть добавлены для увеличения удержания ионных видов путем формирования нейтральных ионных пар, которые разделяются на стационарную фазу. Эти добавки являются мощными, но их трудно удалить из колонки и могут подавлять сигналы масс-спектрометрии.

Влияние органического растворителя и его процент

Наиболее простой способ корректировки удержания — изменение процента органического растворителя. В изократическом элюировании используется постоянная композиция на протяжении всего пробега. В градиентном элюировании органический процент увеличивается с течением времени, позволяя в одном пробеге отделять аналиты с широким диапазоном гидрофобностей.

Изократическая оптимизация

Для данного растворителя уменьшение органического процента увеличивает удержание (выше k') и в целом улучшает разрешение при условии, что время анализа остается приемлемым. Правило большого пальца: k' первого пика должно быть между 1 и 5, а последнего пика между 5 и 20. Если значения k слишком низки, пики выравниваются вблизи пустотного объема; если слишком высоки, время анализа становится чрезмерным и происходит расширение пика.

Однако увеличение удержания также увеличивает риск пикового хвостохранилища и расширения полосы из-за медленного переноса массы в стационарной фазе. Оптимальный органический процент часто обнаруживается при выполнении градиента разведки (например, от 5% до 95% B более 20 минут) и затем выборе изократической композиции, которая фокусирует интересующую область.

Градиентная элюация

Методы градиента необходимы, когда образцы содержат анализы с широким диапазоном полярностей. Наклон градиента (изменение в %В в минуту) значительно влияет на разрешение. Градиенты сгиба сжимают пики, но уменьшают общее разрешение; более мелкие градиенты увеличивают разрешение за счет более длительного времени выполнения. Для критических пар сегментированный градиент (например, неглубокий уклон через интересующую область) может обеспечить необходимое разделение без увеличения общего пробега.

Изменилась избирательность между растворителями

Переход от ацетонитрила к метанолу (или использование смеси) может изменить порядок элюирования тесно связанных соединений. Это происходит потому, что свойства сольватации подвижной фазы по-разному влияют на аналито-стационарные фазовые взаимодействия для каждого соединения. Когда два пика соэлюта в ACN, общим первым шагом является попытка MeOH с эквивалентной прочностью элюирования (например, ACN ~ 1,5× сильнее, чем MeOH по объему). Тренарная смесь может быть оптимизирована с использованием подхода треугольника селективности, хотя это более распространено в разработке метода.

Роль pH и выбор буфера

Для соединений, содержащих ионизируемые функциональные группы (кислоты, основания, звиттерионы), pH водной части подвижной фазы является критическим. Удержание ионизируемого аналита резко изменяется вокруг его pK_a.

• Слабые кислоты (pK_a 3-6: При низком pH (ниже pK_a) аналит нейтрален и удерживается сильно.При высоком pH (выше pK_a) он ионизируется и элюирует ранее.
• Слабые основания (pK_a 6-10): Противоположное поведение: нейтральное при высоком pH, ионизированное при низком pH. Для основных соединений часто проводят разделение при низком pH (например, 2,5-3,5) для поддержания протонации аналита и улучшения пиковой формы на колоннах на основе кремнезема (которые имеют остаточные силаноли).

Для получения воспроизводимых времен удержания подвижный фазовый pH должен буферизоваться в пределах ±0,2 единиц мишени. Обычно используются буферы, такие как фосфат (pK_]a2 = 7,2), ацетат (pK_a = 4,76) и формиат аммония (pK_a = 3,75). Буферы не должны выпадать в осадок при смешивании с органическим растворителем; высокие концентрации фосфатов могут выпадать в высоко-ACN-смесь.

pH и разрешение

Когда два аналита имеют разные значения pK_a, корректировка pH может значительно улучшить разрешение путем изменения состояния ионизации — и, следовательно, удержания — одного соединения, оставляя другое относительно неизменным. Например, карбоновая кислота и нейтральное соединение могут совместно элюировать при pH 7; снижение pH до 3 будет удерживать кислоту более сильно, в то время как удержание нейтрального соединения мало изменяется, потенциально разрешая пару.

Для методов, использующих обнаружение масс-спектрометрии, требуются летучие буферы, такие как ацетат аммония или формат аммония. Нелетучие буферы (например, фосфат) несовместимы с ионизацией электроспрей.

Полезным ресурсом для выбора буфера и управления рН является руководство Sigma-Aldrich по подготовке мобильной фазы HPLC.

Влияние ионной силы и ионно-парных агентов

Ионная прочность относится к общей концентрации ионов в подвижной фазе. Увеличение ионной прочности (путем добавления соли, такой как NaCl или увеличение буферной концентрации) может влиять на удержание несколькими способами:

• Для ионизируемых аналитов более высокая ионная прочность уменьшает электростатическое притяжение или отталкивание между аналитной и остаточной группами силанола на стационарной фазе, часто улучшая пиковую форму и уменьшая хвостохранилище.
• Ионная прочность также может влиять на степень сольватации аналитов, тонко изменяя гидрофобность и удержание.

На практике типичны буферные концентрации от 10 мМ до 50 мМ. Слишком малая ионная прочность приводит к плохой пиковой форме для оснований; слишком много может вызвать осадки или повреждение насосов и уплотнений.

Ионно-парная хроматография

Для сильнополярных или заряженных аналитов, которые показывают малое удержание на стандартных столбцах С18, добавляют ионно-парные реагенты. Эти реагенты имеют гидрофобный хвост и заряженную головную группу. Хвост адсорбирует к неподвижной фазе, создавая псевдоионообменную поверхность. Например, добавление тетрабутиламмония фосфата (гидрофобного катиона) к подвижной фазе увеличит удержание отрицательно заряженных аналитов (например, сульфонатов, нуклеотидов). И наоборот, алкилсульфонаты (например, гептанов сульфоната) могут использоваться для удержания основных соединений.

Методы ионной пары требуют тщательной уравновешивания (часто 10-20 объемов колонок) и могут быть медленными для перебалансировки после градиентных пробегов. Концентрация ионно-парного реагента обычно колеблется от 1 мМ до 20 мМ.

Более подробное руководство по методам ионной пары см. в Беспокойная техническая записка по ионно-парной хроматографии .

Дополнительные модификаторы: температура, добавки

Хотя температура колонки не является строго частью композиции подвижной фазы, она сильно взаимодействует с эффектами подвижной фазы. Повышение температуры снижает вязкость мобильной фазы, снижает обратное давление и, как правило, снижает удержание. Температура также может изменять селективность, особенно для соединений с различным вкладом энтропии в удержание. Многие современные методы используют контролируемые колоночные печи для обеспечения воспроизводимости.

Небольшое количество добавок может также улучшить пиковую форму или включить определенные режимы обнаружения:

• Трифлуоуксусная кислота (TFA) (0,05–0,1% v/v) является обычным ионопарирующим агентом для разделения пептидов, а также действует как модификатор низкого pH. Однако TFA может подавлять сигналы ESI-MS; муравьиная кислота предпочтительна для LC-MS.
• Триэтиламин (TEA) при низких концентрациях (0,1% v/v) может уменьшить хвостохранилище для основных соединений, маскируя активность силанола.
• EDTA иногда добавляют к подвижным фазам в ионы хелата металлов, которые могут вызвать пиковое хвостование для определенных чувствительных к металлу соединений.

Стратегии разработки методов оптимизации мобильной фазы

Современная разработка метода часто следует структурированному рабочему процессу, чтобы минимизировать пробы и ошибки. Общая отправная точка заключается в том, чтобы запустить широкий градиент (например, 5-95% B более 20 минут) на колонке C18 с ACN в качестве органического растворителя. На основе наблюдаемого окна удержания можно оценить изократическую композицию: выберите % B, который дает k' около 2-5 для первого пика интереса.

Дизайн экспериментов (DoE)

Для более сложных разделений программное обеспечение DoE может эффективно исследовать несколько переменных одновременно (например, %B, pH, температура, концентрация буфера). Типичный подход использует ориентированную на лицо центральную композитную конструкцию или конструкцию Box-Behnken с 15-20 прогонами. Модель поверхности отклика затем прогнозирует оптимальные условия и указывает на надежность. Это особенно ценно, когда нормативная валидация требует демонстрации надежности метода.

Скаутинг различных колонн и растворителей

Если разрешение неадекватно после оптимизации мобильной фазы, следующим шагом является попытка использовать другую химию колонок (например, C8, фенил, C18 с полярным встраиванием) или другой органический растворитель. Коммерческие наборы для разработки методов с несколькими колонками позволяют быстро проводить скрининг.

Систематический подход описан в руководстве по разработке метода HPLCWaters, в котором представлены практические шаблоны для скаутинга градиентов и преобразования градиента в изократию.

Еще один отличный ресурс для устранения неполадок - это руководство по устранению неполадок Crawford Scientific HPLC .

Заключение

Состав мобильной фазы является единственным наиболее мощным инструментом для управления разрешением в обратной фазе ВЭЖХ. Методически регулируя тип и процент органического растворителя, уровень pH буфера и ионную прочность, и выборочно используя добавки или ионно-парные реагенты, аналитики могут достичь базового разделения даже для самых сложных аналитных смесей. Твердое понимание основных механизмов удержания - как каждый параметр влияет на эффективность, селективность и фактор удержания - превращает разработку метода из утомительного эмпирического упражнения в рациональный, эффективный процесс.

Достижения в области технологии колонок, оптимизации с программным обеспечением и надежного приборостроения сделали мобильную фазовую оптимизацию более доступной, чем когда-либо.Однако фундаментальные принципы остаются неизменными: тщательное внимание к подготовке мобильной фазы, контролю pH и качеству растворителя имеет важное значение для получения воспроизводимых разделений с высоким разрешением изо дня в день.

Работая в высокопроизводительной лаборатории QC или разрабатывая новый биоаналитический метод, инвестирование времени в понимание и контроль состава мобильной фазы приносит дивиденды в качестве данных, надежности метода и долгосрочной производительности.