Влияние 3d клеточных культур на высокопроизводительный скрининг и разработку лекарств

Введение: новый рубеж в открытии наркотиков

Фармацевтическая промышленность давно столкнулась с постоянной проблемой: подавляющее большинство кандидатов на лекарства, которые демонстрируют многообещающие результаты в доклинических испытаниях на людях, в конечном итоге терпят неудачу в клинических испытаниях. Высокие темпы истощения, особенно на поздних стадиях разработки, увеличивают затраты и задерживают доставку новых методов лечения пациентам. Основным фактором этой неудачи является зависимость от упрощенных клеточных анализов, которые не точно предсказывают биологию человека. Традиционные двумерные (2D) клеточные культуры, в то время как удобные и экономически эффективные, не воспроизводят сложную микросреду живых тканей. Появление трехмерных (3D) систем клеточной культуры знаменует собой сдвиг парадигмы в том, как исследователи подходят к открытию лекарств, предлагая модели, которые позволяют более физиологически релевантные условия, 3D-системы трансформируют высокопроизводительный скрининг (HTS) и весь конвейер разработки лекарств, обещая снизить скорость истощения, сократить сроки и в конечном итоге вывести на рынок более безопасные, более эффективные лекарства.

3D системы клеточной культуры

Физиологический реализм за гранью диш

В основе 3D-системы клеточной культуры лежит любой метод, позволяющий клеткам расти и взаимодействовать во всех трёх пространственных измерениях. В отличие от монослоя, образующегося на плоских пластиковых или стеклянных поверхностях в 2D-культуре, 3D-системы поощряют клетки к принятию морфологий и поведений, которые близко напоминают те, что встречаются в живых организмах. Клетки в 3D могут образовывать межклеточные соединения, осаждать и ремоделировать свой собственный внеклеточный матрикс (ECM) и устанавливать градиенты питательных веществ, кислорода и сигнальных молекул. Эти особенности фундаментально изменяют то, как клетки размножаются, дифференцируются и реагируют на внешние раздражители, включая лекарственные соединения.

Основные типы 3D-платформ для культуры

Область 3D клеточной культуры охватывает широкий спектр технологий, каждая из которых имеет свои преимущества и применение в разработке лекарств.

• Системы на основе каркасов: Они используют природные или синтетические материалы, такие как коллаген, альгинат, гиалуроновая кислота или биоразлагаемые полимеры, для создания структурной структуры, которая имитирует ECM. Клетки сеяны в или на каркас и растут в его пористой архитектуре. Общие примеры включают гидрогели, которые представляют собой сети с водяным опуханием, которые могут быть настроены на жесткость и состав, и децеллюляризованные тканевые матрицы, которые сохраняют нативные биохимические сигналы.
• Системы без каркасов:] В этих подходах клетки побуждаются к самосборке в 3D-агрегаты без внешней поддержки. Висячие капельные пластины, ультранизкие пластины крепления и методы магнитной левитации стимулируют клетки к образованию сфероидов или органоидов. Сфероиды представляют собой компактные кластеры клеток, которые развивают свой собственный ECM, в то время как органоиды представляют собой более сложные структуры, которые содержат несколько типов клеток и повторяют аспекты архитектуры и функции органов.
• Микрофлюидные 3D культуры и орган на чипе: Эти передовые платформы интегрируют 3D-культуру клеток с микрофлюидными каналами, которые пропитывают питательные вещества и удаляют отходы, имитируя динамические физиологические условия, такие как кровоток. Устройства орган на чипе могут содержать несколько типов тканей, связанных микрофлюидными каналами, что позволяет изучать межорганную связь и системные лекарственные эффекты.
• Биореакторные системы: Для более масштабных применений биореакторы обеспечивают контролируемые среды для 3D-культуры с непрерывной циркуляцией среды и газообменом. Эти системы особенно полезны для производства большого количества сфероидов или органоидов для высокопроизводительных применений и для поддержания долгосрочных культур.

Почему 2D-культура не подходит для скрининга на наркотики

Чтобы в полной мере оценить влияние 3D-систем, важно понять ограничения традиционной 2D-культуры в контексте скрининга лекарств. Клетки, выращенные на плоских поверхностях, испытывают неестественные силы адгезии, проявляют измененную полярность и теряют многие тканеспецифические функции. Реакции лекарств в 2D часто не предсказывают результаты in vivo, потому что монослой не представляет барьеров для проникновения лекарств, не воспроизводит гипоксические ядра твердых опухолей и не имеет трехмерной архитектуры, которая управляет сигнализацией и сопротивлением. Это несоответствие является основной причиной высокой скорости ложных срабатываний и ложных негативов в HTS. Соединения, которые кажутся мощными в 2D, могут потерпеть неудачу in vivo, потому что они не могут проникнуть глубоко в ткань, в то время как соединения, которые будут эффективны in vivo, могут быть отклонены из-за токсичности или отсутствия активности, наблюдаемой только в монослойной культуре.

Трансформационное влияние на высокопроизводительный скрининг

Усиление предиктивной достоверности

Наиболее значительным вкладом культуры 3D-клеток в HTS является заметное улучшение прогностической достоверности. Представляя клетки в более родном контексте, 3D-анализы обеспечивают более точное считывание того, как кандидат на препарат будет вести себя в организме. Например, у раковых сфероидов развивается некротическое ядро и гипоксический градиент, похожий на солидные опухоли, что позволяет исследователям оценивать не только цитотоксичность, но и проникновение и активность лекарств в различных микросредах. Это приводит к более надежному ранжированию эффективности соединений и токсичности на ранних этапах скринингового каскада.

Улучшение выявления эффективности и токсичности лекарственных средств

Клетки в 3D-культуре обычно демонстрируют более высокую лекарственную устойчивость, чем их 2D-коллеги, что более точно отражает клиническую реальность. Это означает, что соединения, которые кажутся эффективными в 2D, могут быть отфильтрованы при тестировании в 3D, экономя ресурсы на кандидатах, которые в конечном итоге потерпят неудачу. И наоборот, 3D-культуры могут выявить токсические эффекты, которые маскируются в 2D из-за отсутствия контактов клеток и метаболической кооперации. Например, гепатоциты сфероиды поддерживают специфические функции печени, такие как секреция альбумина и активность цитохрома P450 в течение длительных периодов, обеспечивая надежную платформу для оценки повреждения печени, вызванного лекарственными препаратами, ведущей причиной клинической лекарственной недостаточности.

Снижение ложных положительных и отрицательных

Более физиологически релевантная среда 3D-культуры напрямую приводит к меньшему количеству вводящих в заблуждение результатов скрининга. В 2D многие соединения, влияющие на адгезию клеток или динамику цитоскелета, могут проявлять артефактную активность. В 3D эти эффекты контекстуализируются в рамках более реалистичной тканевой архитектуры. Результатом является более чистый набор данных с более высоким отношением сигнал-шум, что позволяет скрининговым кампаниям расставлять приоритеты действительно многообещающих потенциальных клиентов с большей уверенностью. Это снижение шума скрининга особенно ценно в крупномасштабных кампаниях HTS с участием сотен тысяч соединений.

Интеграция с высококонтентной визуализацией и многоуровневыми анализами

Достижения в технологии визуализации и автоматизации анализа сделали возможным запуск 3D-культур в форматах многолуночных пластин, совместимых с HTS. Конфокальная и световая микроскопия в сочетании с автоматизированным анализом изображений позволяют исследователям одновременно оценивать несколько конечных точек, включая размер сфероидов, морфологию, жизнеспособность, апоптоз и проникновение лекарств. Эти высококонтентные считывания обеспечивают богатый объем информации на скважину, позволяя более глубокое механистическое понимание без увеличения количества пластинок анализа. Такие компании, как Корнинг и PerkinElmer , теперь предлагают специализированные пластины и системы обнаружения, специально оптимизированные для 3D-сфероидных анализов.

Влияние на трубопровод развития наркотиков

Ускорение обнаружения и проверки целей

3D-культура клеток не ограничивается скринингом; она также играет решающую роль в ранней идентификации и валидации мишеней. При изучении механизмов заболевания 3D-модели обеспечивают более точное представление клеточной среды, в которой действует мишень. Например, сфероиды раковых клеток могут выявить роль белков адгезии клеток в лекарственной устойчивости, в то время как органоиды, полученные из опухолей пациента, могут помочь идентифицировать мишени, которые актуальны в контексте неоднородности опухоли. Эта контекстуальная информация помогает расставить приоритеты мишеней, которые с большей вероятностью превратятся в клинический успех.

Оптимизация с более глубоким механистическим пониманием

Во время оптимизации свинца химикам и биологам необходимо понять, как структурные модификации соединения влияют на его эффективность, селективность и абсорбционные, распределительные, обменные и экскреционные свойства (ADME). Системы 3D-культуры обеспечивают более требовательный тест на способность соединения к диффузии, метаболизму несколькими типами клеток и клеточным механизмам эффлюкса. Это позволяет лучше дифференцировать соединения с аналогичной потенцией в 2D, но значительно отличающимся потенциалом in vivo. Интеграция 3D-анализов ADME с использованием гепатоцитов или кишечных органоидов обеспечивает раннее предупреждение о метаболической нестабильности или токсичности до того, как ресурсы будут направлены на исследования на животных.

Сокращение тестирования на животных и продвижение этических исследований

Помимо научных преимуществ, 3D-культура клеток поддерживает принципы 3Rs Replacement, Reduction, and Refinement в исследованиях на животных. Более прогностические модели in vitro могут полностью заменить некоторые исследования на животных, сократить количество животных, необходимых для предоставления более качественных данных ранее, и уточнить протоколы, нацеливаясь на наиболее релевантные конечные точки. Регулирующие органы, включая FDA и EMA, выразили поддержку новым методологиям подхода NA.M., которые могут улучшить оценку безопасности лекарств при одновременном сокращении использования на животных. FDA Predictive Toxicology Roadmap явно поощряет разработку и квалификацию альтернативных методов, включая модели 3D-ткани.

Тематические исследования и применения в терапевтических областях

Онкология: сфероиды и органоиды, полученные от пациентов

Онкология была основным полигоном для 3D-культуры в разработке лекарств. Опухолевые сфероиды широко используются для оценки химиотерапевтических агентов, таргетной терапии и иммунотерапии. Органоиды PDO, полученные от пациентов, представляют собой значительный прогресс в точной медицине. Эти 3D-структуры выращены из опухолевой ткани пациента и сохраняют генетические и фенотипические характеристики исходной опухоли. Скрининг лекарств на PDO может идентифицировать эффективные методы лечения отдельных пациентов и предсказать механизмы резистентности. Крупномасштабные инициативы, такие как Сеть атласов опухолей человека , полагаются на 3D-культуру для картирования клеточной архитектуры опухолей и выявления уязвимостей.

Нейродегенеративные заболевания: органоиды мозга и кокультуры

Моделирование человеческого мозга представляет уникальные проблемы из-за его клеточного разнообразия и сложной архитектуры. Органоиды мозга, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, могут имитировать аспекты развития коры, обеспечивая платформы для изучения таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и расстройства аутистического спектра. Эти 3D-модели позволяют исследователям оценивать лекарственное воздействие на нейронную активность, синаптическую функцию и агрегацию белка в контексте, который гораздо более актуален, чем культуры 2D нейронов. Например, органоиды использовались для скрининга соединений, которые уменьшают агрегацию амилоид-бета или защищают от токсичности альфа-синуклеина.

Токсичность печени: сфероиды гепатоцитов и кокультуры

Медикаментозное повреждение печени DILI остается ведущей причиной послепродажного вывода лекарств. Первичные гепатоциты человека быстро теряют функцию в 2D-культуре, ограничивая их полезность для долгосрочного тестирования токсичности. Гепатоциты и 3D-кокультуры с непаренхиматозными клетками, такими как клетки Купфера и звездчатые клетки, поддерживают специфические функции печени в течение нескольких недель, что позволяет повторно дозировать и оценивать хроническую токсичность. Эти модели обеспечивают более точный прогноз клинического DILI, с исследованиями, показывающими, что 3D-культуры могут идентифицировать гепатотоксические соединения, которые пропускаются обычными 2D-анализами.

Решение текущих проблем

Стоимость, сложность и масштабируемость

Несмотря на явные преимущества, широкое внедрение 3D-культуры клеток в HTS сталкивается с препятствиями. 3D-системы, как правило, дороже 2D-культур из-за стоимости специализированных пластин, каркасов, факторов роста и реагентов для визуализации. Техническая сложность генерации однородных сфероидов или органоидов в масштабе требует специализированного оборудования и обученного персонала. Переменность в размере сфероидов и морфологии может вносить шум в данные скрининга, если не тщательно контролировать. Исследователи и поставщики работают над решением этих проблем, разрабатывая автоматизированные платформы генерации сфероидов, определенные культурные среды и стандартизированные показатели контроля качества.

Разработка и валидация анализа

Адаптация традиционных технологий анализа к 3D-форматам не всегда проста. Многие методы обнаружения на основе флуоресценции страдают от плохого проникновения в сфероиды или органоиды, что приводит к неточным измерениям. Анализы АТФ на основе люминесценции могут быть адаптированы, но требуют оптимизации условий лизиса и обнаружения. Высокосодержание изображения требует передовых трубопроводов сбора и анализа, которые могут справиться со сложностью 3D-структур. Область сходится на передовой практике с помощью таких инициатив, как Национальный центр продвижения трансляционных наук NCATS 3D клеточные культуры руководящие принципы , которые предоставляют рекомендации для генерации сфероидов, характеристики и реализации анализа.

Стандартизация и воспроизводимость

Как и в случае с любой новой технологией, воспроизводимость в лабораториях остается проблемой. Различия в клеточных источниках, средах культивирования, методах генерации сфероидов и протоколах анализа могут привести к различным результатам. Установление эталонных стандартов и сертифицированных контрольных материалов значительно повысит надежность 3D-анализов. Такие усилия, как руководящие принципы ОЭСР для путей неблагоприятных результатов и разработка международно признанных протоколов для 3D-культуры, имеют решающее значение для обеспечения того, чтобы технология могла быть доверена для принятия решений регулирующими органами.

По мере развития технологии разработка стандартизированных протоколов и нормативной квалификации конкретных 3D-анализов будет иметь решающее значение для широкого внедрения. FDA и другие регулирующие органы активно работают над рамками для оценки и принятия NAM. Квалификация конкретных 3D-анализов клеточной культуры для оценки безопасности, таких как модель гепатоцитов сфероидов для DILI, ускорит принятие фармацевтических препаратов и обеспечит четкий путь для включения 3D-данных в нормативные представления. Стратегия регуляторной науки EMA также подчеркивает важность альтернативных методов, которые могут улучшить предсказуемость неклинического тестирования.