Достижения в области криоэм для структурной биологии и медицинских исследований

Криоэлектронная микроскопия (Cryo-EM) изменила ландшафт структурной биологии, предлагая исследователям мощную линзу для изучения биологических макромолекул в их родном, витрифицированном состоянии. Обойдя необходимость кристаллизации, эта техника позволила получить подробные представления о сложных молекулярных механизмах, которые ранее были недоступны. Влияние простирается от фундаментальной биологии до медицинских исследований, где структуры с высоким разрешением ускоряют разработку вакцин, терапевтических и диагностических инструментов. По мере развития технологии Cryo-EM готова стать еще более важной для понимания жизни на молекулярном уровне и перевода этих знаний в клинические применения.

Что такое Cryo-EM?

Криоэлектронная микроскопия — это форма трансмиссионной электронной микроскопии, где биологические образцы быстро замораживаются в тонком слое стекловидного льда. Этот процесс, называемый витрификацией, сохраняет нативную гидратацию, структурную целостность и конформационные состояния молекул. В отличие от рентгеновской кристаллографии, которая требует упорядоченных кристаллов, или ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии, которая ограничена относительно небольшими белками, Cryo-EM может обрабатывать большие динамические сборки, такие как рибосомы, мембранные белки и вирусы. Методика включает сбор тысяч двумерных проекционных изображений отдельных частиц в случайных ориентациях. Передовые вычислительные алгоритмы затем выравнивают и усредняют эти изображения для реконструкции трехмерной карты плотности при почти атомном разрешении.

Метод получил широкое признание после 2013 года, когда детекторы прямых электронов и улучшенное программное обеспечение для обработки изображений выдвинули разрешение белковых структур за пределы 3 ангстремов.В 2017 году Нобелевская премия по химии была присуждена Жаку Дюбочету, Иоахиму Франку и Ричарду Хендерсону за разработку Cryo-EM, закрепив его статус революционного инструмента в структурной биологии.

Последние технологические достижения

За последнее десятилетие ряд инноваций резко увеличил разрешение, пропускную способность и доступность Cryo-EM. Эти достижения превратили то, что когда-то было нишевой техникой, в основной метод, используемый сотнями лабораторий по всему миру.

Прямые детекторы электронов

Традиционные ПЗС-камеры и пленка были ограничены низкой детективной квантовой эффективностью (DQE) и значительным шумом. Прямые электронные детекторы, такие как серии Falcon и K3, непосредственно захватывают электроны без сцинтиллятора, предлагая высокую чувствительность и быструю скорость считывания. Эти детекторы могут записывать фильмы электронного пучка, взаимодействующего с образцом, что позволяет коррекцию движения, вызванного пучком, и выбор только лучших кадров. Это было критически важно для достижения разрешений лучше, чем 2 ангстрема для хорошо проведенных образцов.

Алгоритмы обработки изображений

В этой области произошла революция в вычислительных методах, особенно в областях сбора, выравнивания и классификации частиц. Подходы с максимальной вероятностью и байесовские выводы, реализованные в таких программах, как RELION, cryoSPARC и cisTEM, позволили почти автоматическую обработку больших наборов данных. Такие методы, как анализ 3D-вариабельности и уточнение нескольких тел, позволяют исследователям исследовать конформационные ландшафты и динамику. Интеграция глубокого обучения, особенно через сверточные нейронные сети для сбора и деноизации частиц, продолжает раздвигать границы того, что можно извлечь из шумных изображений.

Инновации по подготовке образцов и витрификации

Последовательное и воспроизводимое витрификацию по-прежнему является узким местом для многих проектов.

• Оксид графена и золотые сетки: Они обеспечивают стабильный опорный слой, который уменьшает движение, вызванное лучом, и частичную зарядку.
• Саморазрушающие сетки и безотходные устройства (например, Spotiton), которые минимизируют отходы образца и улучшают согласованность.
• Разрешенные временем Cryo-EM с использованием микрофлюидных смесителей, которые позволяют быстро смешивать реагенты перед витрификацией, захватывая мимолетные промежуточные состояния.
• Фазовые пластины (как на основе Вольты, так и на основе лазера), которые усиливают контраст для более мелких частиц, что позволяет проводить анализ с высоким разрешением белков суб-100 кДа.

Эти инструменты делают Cryo-EM более доступным для сложных целей, включая небольшие мембранные белки и внутренние неупорядоченные области.

Автоматизация и высокая производительность

Современные электронные микроскопы, оснащенные автоматизированным программным обеспечением для сбора данных, могут собирать десятки тысяч микрофотографий за ночь с минимальным вмешательством человека. Такие системы, как EPU, Leginon и SerialEM, позволяют без присмотра приобретать, а интеллектуальные инструменты скрининга отдают приоритет квадратам сетки с оптимальной толщиной льда и распределением частиц. Эта автоматизация позволила реализовать крупномасштабные структурные геномные инициативы и быструю характеристику вирусных белков во время вспышек.

Влияние на структурную биологию

Достижения в области крио-ЭМ коренным образом изменили то, как исследователи изучают биологические молекулы. Структуры, которые когда-то считались невозможными для решения, теперь регулярно определяются в течение нескольких недель или месяцев.

Мембранные белки и ионные каналы

Мембранные белки, как известно, трудно кристаллизуются из-за их гидрофобной природы. Крио-ЭМ был особенно мощным для изучения рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), ионных каналов, транспортеров и рецепторов в комплексе с лигандами или сигнальными партнерами. Например, структура ионного канала TRPV1 в нескольких функциональных состояниях освещала механизм восприятия температуры. Аналогично, комплекс γ-секретазы человека, мишень для болезни Альцгеймера, был впервые решен Cryo-EM при атомном разрешении, показывая, как он обрабатывает белок-предшественник амилоида.

Большие макромолекулярные машины

Рибосомы, сплайсосомы, протеасомы и другие крупные узлы были широко изучены Cryo-EM. Техника превосходит визуализацию этих комплексов, потому что они достаточно велики, чтобы генерировать сильный контраст и могут быть очищены в стабильных, функциональных формах. Динамическая природа рибосомы во время трансляции была захвачена в почти анатомическом разрешении, обеспечивая снимки удлинения, терминации и связывания с антибиотиками. Эти идеи направляют разработку новых антибиотиков, которые нацелены на бактериальные рибосомы с высокой специфичностью.

Вирусы и вирусные белки

Вирусы являются естественными мишенями для Cryo-EM из-за их размера, симметрии и биологической важности. Методика использовалась для определения структур целых вирусов, включая Зика, денге, ВИЧ и SARS-CoV-2. Спайк-белок SARS-CoV-2 был решен в течение нескольких недель пандемии, показывая его конформацию и эпитопы для нейтрализации антител. Эти структуры непосредственно информировали о разработке мРНК-вакцин и терапевтических антител. Помимо окутанных вирусов Cryo-EM разрешил капсиды аденовирусов, бактериофагов и комплексов репликации гепатита С.

Визуализация динамики и конформационных ансамблей

Последние достижения в обработке данных Cryo-EM позволяют исследователям выйти за рамки одной статической структуры. Такие методы, как 3D классификация и , описывают непрерывные конформационные изменения молекул. Например, изучение рибосомы при транслокации выявляет множественные состояния, которые интерконвертируются в растворе. Разрешенный временем Cryo-EM, используя микрофлюидные смесители или лазерную витрификацию, может захватывать промежуточные соединения на миллисекундных временных масштабах. Эта динамическая информация имеет решающее значение для понимания аллостерии, ферментативного катализа и сигнальной трансдукции.

Приложения в медицинских исследованиях

Способность Cryo-EM обеспечивать структуры с высоким разрешением белков и комплексов, связанных с заболеваниями, в их естественной среде делает его незаменимым инструментом в биомедицинских исследованиях и разработке лекарств.

Развитие вакцин

Наиболее заметным недавним успехом является роль Cryo-EM в разработке вакцин против SARS-CoV-2. Структура белка префузионного шипа, стабилизированного мутациями пролина (S-2P), была решена с использованием Cryo-EM и стала антигеном для мРНК вакцин Moderna и Pfizer-BioNTech. Этот подход был распространен на другие вирусы, включая респираторно-синцитиальный вирус (RSV), где Cryo-EM руководил стабилизацией префузионного белка F. Полученная вакцина показала высокую эффективность в клинических испытаниях. Аналогично, Cryo-EM используется для разработки широко нейтрализующих антител и эпитоп-ориентированных иммуногенов для ВИЧ.

Открытие лекарств и структурный дизайн лекарств

Cryo-EM трансформирует конвейер обнаружения лекарств, предоставляя подробные карты лекарственных мишеней в комплексе с потенциальными кандидатами. В отличие от рентгеновской кристаллографии, которая часто требует замачивания или кокристаллизации с небольшими молекулами, Cryo-EM может визуализировать связывание лекарств непосредственно в контексте полноразмерного белка, часто с почти атомным разрешением. Это было особенно мощным для таких мишеней, как , связанные с мембраной протеазы , ионные каналы и большие сигнальные комплексы , которые трудно кристаллизоваться. Например, Cryo-EM использовался для определения структуры человеческого P-гликопротеина с связанными ингибиторами, помогая разработке лекарств, которые преодолевают множественную лекарственную устойчивость при раке.

Фармацевтические компании все чаще полагаются на Cryo-EM для фрагментарного скрининга, где небольшие молекулярные библиотеки пропитываются образцами белка и для выявления попаданий решаются множественные структуры низкого разрешения. Такой подход может быть быстрее традиционных методов скрининга и обеспечивает прямую структурную информацию о сайтах связывания. Также методика применяется для изучения связывания антител с трудными мишенями, такими как рецепторы, связанные с G-белком, что позволяет разрабатывать биологические методы лечения.

Генетические и редкие заболевания

Мутации, нарушающие структуру и функцию белков, часто приводят к генетическим нарушениям. Крио-ЭМ позволяет исследователям сравнивать архитектуру белков дикого типа и мутантных белков, раскрывая механистические основы болезни. Например, структурные исследования канала трансмембранного проводимости кистозного фиброза (CFTR) с использованием Cryo-EM показали, как определенные мутации (например, F508del) влияют на канальное галстукирование и чувствительность к лекарственным средствам. Эти знания стимулируют развитие корректоров и потенциаторов следующего поколения. Аналогично, Cryo-ЭМ используется для характеристики дисфункциональных сплайсосомных комплексов при спинальной мышечной атрофии и дегенерации сетчатки.

Антимикробная резистентность

Растущая угроза антибиотикорезистентных бактерий подстегнула интерес к использованию Cryo-EM для разработки новых противомикробных препаратов. Структуры бактериальных рибосом с несколькими антибиотиками выявили механизмы резистентности и предоставили шаблоны для модификации существующих лекарств. Cryo-EM также применялся для изучения бактериальных эффлюксных насосов, таких как система AcrAB-TolC, и для визуализации сборки механизмов деления бактериальных клеток. Эти идеи открывают новые возможности для разработки соединений, которые непосредственно нацелены на механизмы резистентности.

Будущие направления

Темпы технологических инноваций в Cryo-EM не показывают признаков замедления. Несколько новых тенденций обещают еще больше расширить его полезность в исследованиях и медицине.

Интеграция с искусственным интеллектом

Машинное обучение и ИИ интегрируются на каждом этапе рабочего процесса Cryo-EM. Методы глубокого обучения теперь могут прогнозировать положения частиц, оценивать параметры CTF и обесценивать микрографы с замечательной точностью. Возможно, наиболее захватывающим является использование передовых алгоритмов для реконструкции карт плотности из шумных данных, что позволяет создавать карты с более высоким разрешением из меньшего количества частиц. В ближайшем будущем системы, управляемые ИИ, могут автоматизировать весь трубопровод от загрузки образца до окончательного осаждения структуры.

Криоэлектронная томография (Cryo-ET)

В то время как одночастичная Cryo-EM в среднем составляет тысячи идентичных молекул, криоэлектронная томография (cryo-ET) отображает уникальные объекты, такие как органеллы, вирусы и клеточные структуры, в трех измерениях. Достижения в фазовых пластинах, энергетических фильтрах и прямых детекторах позволяют достичь разрешения субнанометра in situ. Cryo-ET использовался для визуализации молекулярной архитектуры синапсов, внутренней части бактериальных клеток и сборки вирусных фабрик. Сочетание крио-ET со средневзвешенной субтомограммой сокращает разрыв между структурной биологией высокого разрешения и клеточной биологией.

Высокопроизводительная и автоматическая система для структурной геномики

Масштабные усилия по определению структур всех белков человека или всех белков в патогене становятся возможными благодаря автоматизации. Такие объекты, как Национальный центр крио-ЭМ в Национальной лаборатории Фредерика и eBIC в Великобритании, обеспечивают высокопроизводительный доступ к микроскопам и вычислительным ресурсам. В сочетании с достижениями в подготовке образцов, вскоре может быть возможно решить тысячи структур в год, ускоряя фундаментальные исследования и позволяя исследования на уровне популяции генетических вариантов.