Инженерные подходы к лечению диабетической раны

Бремя диабетических ран и необходимость сосудистой регенерации

Диабетические раны, в первую очередь хронические язвы стопы, затрагивают примерно 15-25% людей с сахарным диабетом в течение их жизни. Эти раны накладывают ошеломляющее клиническое и экономическое бремя: они являются основной причиной нетравматических ампутаций нижних конечностей во всем мире и способствуют значительному увеличению заболеваемости и смертности. Основополагающей патологией является триада периферической нейропатии, заболевания периферических артерий и нарушения иммунной функции, но критическим общим знаменателем является неспособность раны создать функциональную сосудистую сеть. Без адекватной перфузии ткани остаются гипоксическими, лишенными питательных веществ и неспособными установить надлежащий ответ на заживление. Сосудистая тканевая инженерия появилась в качестве преобразующей стратегии для решения этого фундаментального дефицита путем активного содействия неоваскуляризации - образованию новых кровеносных сосудов - в враждебной раневой микросреде.

Традиционная помощь при ранах (оторжение, инфекционный контроль, разгрузка и влажные повязки) часто не может достичь закрытия хронических диабетических ран, потому что это не исправляет основную сосудистую недостаточность. Расширенные методы лечения, такие как гипербарический кислород, актуальные факторы роста (например, бакаплермин) и биоинженерные заменители кожи, обеспечивают некоторую пользу, но их эффективность остается неоптимальной и непоследовательной. сосудистая тканевая инженерия стремится преодолеть эти ограничения, используя комбинацию биосовместимых каркасов, терапевтических клеток и биологически активных молекул для восстановления микрососудистой системы с нуля. В этой статье рассматриваются современное состояние техники, подчеркивая ключевые стратегии, последние достижения и наиболее насущные проблемы на пути к клиническому переводу.

Патофизиология нарушения заживления ран при диабете

Тщательное понимание среды диабетической раны необходимо для понимания того, почему необходимы подходы к сосудистой тканевой инженерии. Хроническая гипергликемия вызывает каскад молекулярных и клеточных дисфункций, которые в совокупности препятствуют нормальному заживлению.

Нейропатия и ишемия

Потеря защитного ощущения приводит к повторным травмам и незамеченным инфекциям, а вегетативная дисфункция вызывает снижение потоотделения и сухой, измельченной кожи. Болезни периферических артерий сокращают приток крови к конечностям, ещё больше компрометируют доставку кислорода и питательных веществ. Получившаяся ишемия создаёт порочный круг: низкие напряжения кислорода ухудшают пролиферацию фибробластов, синтез коллагена и функцию лейкоцитов.

Нарушение ангиогенеза

Ангиогенез в диабетических ранах дисрегулярован на нескольких уровнях. Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭПК) уменьшены в количестве и демонстрируют уменьшенную миграционную способность. Раневое ложе показывает дисбаланс проангиогенных факторов (например, сосудистого эндотелиального фактора роста, VEGF) и антиангиогенных факторов (например, тромбоспондин-1, ингибиторы матриксной металлопротеиназы). Несмотря на то, что уровни VEGF могут быть повышены, кровеносные сосуды, которые образуются, часто незрелые, протекающие и склонные к регрессии. Кроме того, внеклеточный матрикс (ЭКМ) подвергается неферментативной гликации, что делает его устойчивым к ремоделированию и неспособным обеспечить надлежащие ориентировочные сигналы для капиллярного прорастания.

Стойкое воспаление и инфекция

Длительная воспалительная фаза, обусловленная дисфункциональными макрофагами и повышенным уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6), создает протеолитические среды, которые разрушают факторы роста и компоненты ECM. Биофильмобразующие бактерии еще больше усугубляют воспаление и разрушение тканей, затрудняя выживание и созревание новых сосудов.

Учитывая эту многогранную патологию, любая успешная стратегия сосудистой инженерии должна не только поставлять новые сосуды, но и модулировать местную среду для поддержания их выживания и интеграции.

Основные принципы Vascular Tissue Engineering

Цель сосудистой тканевой инженерии для заживления ран состоит в создании патентных, функциональных и прочных микрососудов, которые могут анастомозировать с циркуляцией хозяина и восстановить перфузию. Классическая парадигма тканевой инженерии объединяет три элемента: каркас, клетки и сигнальные молекулы. В контексте заживления ран при диабете каждый компонент должен быть адаптирован к уникальным проблемам хронической раны.

Дизайн и интеграция этих элементов быстро развивались в течение последнего десятилетия, чему способствовали достижения в области материаловедения, клеточной биологии и производственных технологий.

Биоматериальные леса для васкуляризации

Эшафот является физическим хребтом любой сосудистой инженерной конструкции. Он должен поддерживать выживание клеток, позволять диффузию кислорода и питательных веществ и разрушаться со скоростью, соответствующей созреванию неовесселя. Для диабетических ран эшафот также должен выдерживать протеолитические и воспалительные среды.

Природные биополимеры

Коллаген, желатин, фибрин, гиалуроновая кислота и альгинат обычно используются из-за присущих им биоактивности и мотивов клеточной адгезии. Фибрин, полученный из свертывающего кровь каскада, особенно привлекателен: его можно получать из собственной крови пациента (аутологичный), нагруженный клетками и факторами роста, и вводить в виде геля, который полимеризует in situ. Однако природные каркасы часто имеют плохую механическую прочность и быстро разрушаются в диабетических ранах из-за повышенной активности протеаз. Химическое сшивание (например, генипин, глютаральдегид) может улучшить стабильность, но может снизить биосовместимость.

Синтетические полимеры

Полиэфиры, такие как поли(молочная ко-гликолевая кислота) (PLGA), поликапролактон (PCL) и поли(этиленгликоль) (PEG), широко используются, поскольку они обеспечивают настраиваемые скорости деградации и механические свойства. Было показано, что электроспуновые нановолоконные маты PCL поддерживают прикрепление и выравнивание эндотелиальных клеток, имитируя фибриллярную архитектуру нативного ECM. Продвинутые составы включают проангиогенные пептиды (например, REDV, YIGSR) или гепаринсвязывающие домены для иммобилизации факторов роста и высвобождения их контролируемым образом.

Децеллюлярная внеклеточная матрица

Децеллюляризованная дерма или малая кишечная подслизистая оболочка сохраняет нативный состав и ультраструктуру ECM, обеспечивая более физиологически релевантный шаблон, чем синтетические каркасы. Эти материалы способствуют конструктивному ремоделированию и продемонстрировали перспективность в доклинических моделях диабетических ран. Однако проблема вариабельности, риска передачи заболевания и ограниченной масштабируемости остается актуальной.

Гидрогели для контролируемого высвобождения

Инъекционные гидрогели, особенно те, которые получены из гиалуроновой кислоты или ПЭГ, позволяют минимально инвазивную доставку клеток и факторов роста непосредственно в раневое ложе. Они могут быть разработаны для деградирования в ответ на специфические ферменты, переэкспрессированные в хронических ранах (например, матричные металлопротеиназы), достижение «умного» высвобождения терапевтических полезных нагрузок только там и тогда, когда это необходимо. Задача заключается в достижении скорости деградации, которая соответствует временному течению ангиогенеза (обычно 7-14 дней для функциональных капиллярных сетей).

клеточные стратегии

Клеточная сосудистая инженерия направлена на заселение раневого ложа клетками, способными формировать и стабилизировать новые сосуды.

Эндотелиальные клетки и клетки-предшественники эндотелия

Зрелые эндотелиальные клетки (например, эндотелиальные клетки пуповинной вены человека, HUVEC) могут образовывать капиллярные структуры при засеянии на каркасах, но они являются аллогенными и могут вызывать иммунный отторжение. Аутологичные EPC, выделенные из периферической крови или костного мозга, более привлекательны, поскольку они избегают иммунных барьеров и проявляют повышенный пролиферативный потенциал. Клинические испытания с использованием EPC для заживления диабетических ран показали улучшения перфузии и заживления ран, но результаты непоследовательны, вероятно, из-за снижения функциональности EPC у пациентов с диабетом. Предварительное кондиционирование EPC с гипоксией или факторами роста до трансплантации может частично восстановить их ангиогенную способность.

Мезенхимальные стволовые клетки

МСК из костного мозга, жировой ткани или пуповины являются мощными паракринными фабриками. Они выделяют VEGF, bFGF, фактор роста гепатоцитов и ангиопоэтин-1, которые способствуют ангиогенезу хозяина. Кроме того, МСК модулируют воспалительную среду и усиливают поляризацию макрофагов в сторону прорегенеративного (M2) фенотипа. МСК жирового происхождения особенно распространены и могут быть получены посредством липосакции с минимальной заболеваемостью. В сочетании с каркасами было показано, что МСК увеличивают плотность микрососудов в диабетических ранах грызунов до 200% по сравнению с контрольными каркасами.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные из эндотелиальных клеток

Технология iPSC предлагает неограниченный источник эндотелиальных клеток, специфичных для пациента. Недавние протоколы достигли дифференциации иПСК с высокой чистотой в функциональные артериально-венозные и лимфатические эндотелиальные подтипы. Однако риск опухолевости (из-за остаточных недифференцированных клеток) и высокая стоимость производства являются значительными препятствиями. Доклинические исследования с использованием гидрогелей, нагруженных iPSC-EC, продемонстрировали неоваскуляризацию в мышиных диабетических ранах, с доказательствами интеграции сосудов хозяина через 14 дней.

Системы ко-культуры

Зрелые, стабильные сосуды требуют не только эндотелиальных клеток, но и клеток перисосудистой поддержки — перицитов и клеток гладкой сосудистой мышцы — для обеспечения структурной целостности и ангиогенной регуляции. Кокультуры ECs с МСК (которые могут дифференцироваться в перициты) на волокнистых каркасных лесах приводят к более прочным, долговечным капиллярным сетям, чем только ECs. Этот подход более точно повторяет нативное сосудистое развитие и является основным направлением текущих исследований.

Факторы роста и контролируемые системы доставки

Экзогенная доставка рекомбинантных факторов роста может стимулировать ангиогенез, но системное или местное применение ограничено быстрым клиренсом, протеолитической деградацией и потенциальными неблагоприятными последствиями.Поэтому были разработаны системы контролируемого высвобождения для доставки факторов локально, устойчивым образом и в физиологически значимых дозах.

Ключевые факторы роста

Стратегии доставки

Скаффолды могут служить депо для факторов роста. Гепарин-функционализированные гидрогели связывают положительно заряженные факторы роста посредством электростатических взаимодействий, высвобождая их медленно по мере деградации гидрогеля. Микросферы (PLGA, хитозан) инкапсулируют факторы роста и могут быть встроены в каркас для бифазного высвобождения. Альтернативно, генная терапия позволяет клеткам внутри раны непрерывно вырабатывать факторы роста, избегая необходимости повторных применений.

Генная терапия и подходы к редактированию генов

Генная терапия направлена на доставку нуклеиновых кислот (ДНК, мРНК или siРНК) к клеткам в ране для содействия устойчивой экспрессии проангиогенных белков. Вирусные векторы (аденовирус, аденоассоциированный вирус, лентивирус) обеспечивают высокую эффективность трансдукции, но несут риски иммуногенности и инсерционного мутагенеза. Невирусные векторы (плазмидная ДНК, липидные наночастицы, полиэтиленимины) являются более безопасными, но менее эффективными.

Доклинические успехи

Внутрикожная инъекция плазмиды, кодирующей VEGF (phVEGF) в диабетических ранах мышей, значительно улучшила ангиогенез и ускоренное закрытие ран. Клиническое исследование фазы I с использованием плазмиды VEGF-2 (pCK-VEGF165), доставленной с помощью электропорации, показало улучшение заживления ран при незаживающих ишемических язвах. Совсем недавно технология CRISPR-Cas9 использовалась для редактирования клеток ex vivo для повышения регуляции эндогенной экспрессии VEGF. Например, МСК, спроектированные для сверхэкспрессии VEGF-165, а затем встроенные в коллагеновый каркас, улучшили заживление ран у диабетических крыс на 40% по сравнению с МСК дикого типа.

Соображения и ограничения

Долгосрочная безопасность, нецелевые эффекты и регуляторные препятствия остаются значительными. Хаотическая раневая среда может вызывать неконтролируемую экспрессию трансгенов, приводя к аномалиям сосудов. Более того, стоимость и сложность производства генно-редактированных методов лечения для каждого пациента еще не масштабируемы.

Передовые технологии изготовления

Способность точно контролировать архитектуру каркаса в микро- и наномасштабе произвела революцию в сосудистой тканевой инженерии.

3D биопечать

Биопечать позволяет осаждению нагруженных клетками гидрогелей в послойных узорах создавать сосудистые сети с определенной геометрией. Жертвенные биоинки (например, желатин, Pluronic F127) можно печатать и позже удалять, чтобы оставить после себя взаимосвязанные каналы, которые впоследствии эндотелиализируются. Недавние работы продемонстрировали, что биопечатные конструкции, содержащие HUVEC и MSC, при имплантации в диабетические раны мыши, анастомоз с сосудистой системой хозяина в течение 7 дней. Проблемы включают разрешение (меньшие капилляры трудно печатать), вязкость биоинки и жизнеспособность клеток во время печати.

электроспиннинг

Электроспиннинг производит нановолоконные маты, имитирующие волокнистую природу ECM. Выравнивая волокна, исследователи могут направлять ориентацию эндотелиальных клеток и способствовать направленному ангиогенезу. Двухслойные электроспуновые каркасы (например, плотный нижний слой для предотвращения инфильтрации клеток и пористый верхний слой для васкуляризации) были использованы для создания дермальных заменителей, которые поддерживают как эпидермальную, так и сосудистую регенерацию.

Микрожидкостные системы

Микрофлюидные устройства позволяют изучать ангиогенез в контролируемых условиях потока и быстрый скрининг проангиогенных агентов. Они также могут быть использованы для предварительной васкуляризации каркасов in vitro перед имплантацией. Было показано, что микрофлюидная платформа, содержащая параллельные эндотелиализованные каналы, встроенные в фибриновый гель, генерирует перфузируемые микрососуды, которые могут быть непосредственно имплантированы в раны.

Доклинический и клинический ландшафт

Хотя большинство подходов к сосудистой тканевой инженерии все еще находятся в доклиническом тестировании, некоторые из них продвинулись до клинической оценки.

Известные доклинические исследования

Клинические испытания

В ходе второго этапа испытаний (NCT02535624) оценивали фибриновый гель, содержащий аутологичные EPC для хронических диабетических язв стопы. Первичная конечная точка - полное закрытие раны на 12 неделе - была достигнута у 54% пациентов, получавших лечение, по сравнению с 32% в стандартной группе лечения, статистически значимое улучшение. Однако показатели долгосрочного рецидива не были выше. Другое раннее исследование (NCT03217123) доставляло аллогенные МСК через распыление на фибрине у 20 пациентов и наблюдалось увеличение чрескожного кислородного напряжения и уменьшение площади язвы. Большие, рандомизированные, двойные слепые испытания срочно необходимы для подтверждения эффективности и установления оптимальных параметров дозирования и доставки.

Проблемы и будущие направления

Несмотря на значительный прогресс, остаются некоторые барьеры, прежде чем сосудистая тканевая инженерия может стать стандартом лечения диабетических ран.

Иммунный ответ и воспаление

Аллогенные клетки и даже некоторые каркасные материалы могут вызвать иммунный отторжение. Аутологичные клетки у больных диабетом часто дисфункциональны, а их кондиционирование добавляет время и стоимость. Иммуномодулирующие каркасы (например, высвобождающие IL-4 или IL-10) разрабатываются для создания толерогенной раневой среды. В некоторых случаях может потребоваться сочетание с системной иммуносупрессией.

Гипоксия и окислительный стресс

Даже после имплантации каркаса раневое ядро остается гипоксическим до тех пор, пока не проткнутся неовессели. Этот начальный период вызывает стресс у трансплантированных клеток. В настоящее время изучаются такие стратегии, как кислород-генерирующие каркасы (например, включение пероксида кальция или гемоглобина) или сверхэкспрессия антиоксидантных ферментов в клетках.

Управление архитектурой и стабильностью судна

Случайный, неконтролируемый ангиогенез может производить дезорганизованные, протекающие сосуды, которые не могут поддерживать поток. Спатиотемпоральный контроль представления фактора роста - например, градиент VEGF и PDGF - может направлять ориентацию и созревание сосудов. Расширенная биопечать может в конечном итоге позволить печать иерархических сосудистых деревьев. Однако перевод этих конструкций с настольной до постели остается серьезной проблемой производства.

Масштабируемость, регуляторные барьеры и стоимость

Многие из наиболее перспективных конструкций требуют сложного многоступенчатого производства в условиях надлежащей производственной практики (GMP). Подходы, ориентированные на пациента (например, клетки, полученные из iPSC), пока не являются экономически жизнеспособными для широкого использования. Готовые, криоконсервированные или лиофилизированные конструкции, которые могут быть восстановлены в месте оказания медицинской помощи, представляют собой более практичный путь. Регулирующие органы требуют строгих данных о безопасности и эффективности, включая долгосрочное наблюдение за опухолевостью и иммуногенностью.

Персонализированная и точная медицина

Неоднородность диабетических ран — различные этиологии, инфекционные статусы и сопутствующие заболевания пациентов — подразумевает, что ни одна инженерная конструкция не подойдет всем. Будущие подходы, вероятно, включают диагностические инструменты (например, профилирование экспрессии генов раневой биопсии, микробиомика) для выбора каркаса, клеточных и лекарственных комбинаций. «Умные» биоматериалы, которые выделяют факторы в ответ на рН, температуру или ферментативную активность, являются активными границами исследований.

Интеграция с другими технологиями

Сочетая конструкции с устройствами для обеззараживания, раневой терапией с отрицательным давлением и антимикробными агентами, будет иметь важное значение для клинического успеха. Нанотехнологии, такие как использование наночастиц золота для фототермической модуляции ангиогенеза или углеродных нанотрубок для электропроводности и клеточного руководства, могут еще больше улучшить результаты.

Заключение

Сосудистая тканевая инженерия имеет огромные перспективы для решения ключевого механизма отказа в заживлении диабетических ран: неадекватная перфузия. Объединив биомиметические каркасы, мощные клетки и контролируемое высвобождение факторов роста, исследователи продемонстрировали, что функциональные, прочные микрососуды могут быть регенерированы даже в суровой микросреде диабетической раны. Достижения в 3D-биопечати, биологии стволовых клеток и редактировании генов ускоряют прогресс, перемещая область от лабораторных любопытств к клинической реальности. Тем не менее, проблемы, связанные с иммунным отторжением, масштабируемостью, стоимостью и неоднородностью ран, остаются существенными. Продолжающееся междисциплинарное сотрудничество между инженерами, биологами и клиницистами, наряду со строгим дизайном клинических испытаний, будет иметь важное значение для перевода этих инноваций в методы лечения, которые предотвращают ампутации и улучшают жизнь миллионов пациентов с диабетом во всем мире.

Внешние ресурсы: Для дальнейшего чтения проконсультируйтесь с Национальным институтом диабета и болезней органов пищеварения и почек (]NIDDK Foot Ulcer Information), Американской ассоциацией диабета (]Руководство по здоровью пищевых продуктов ), а также с недавними обзорами по сосудистой тканевой инженерии в Переводной медицине стволовых клеток и Биоматериалы.