Интеграция микрожидкостных систем в модели сосудистой ткани для улучшения функциональных возможностей

Модели сосудистой ткани являются важными инструментами в биомедицинских исследованиях, позволяя ученым изучать кровеносные сосуды, сосудистые заболевания и реакции на лекарства в контролируемых средах. Традиционные системы статической культуры, однако, не в состоянии воспроизвести динамические механические и биохимические сигналы, которые испытывают кровеносные сосуды в организме. Интеграция микрожидких систем в эти модели возникла как мощная стратегия преодоления этих ограничений. Благодаря точному контролю потока жидкости в микромасштабе, микрожидкостные сосудистые модели воспроизводят физиологически релевантные сдвига напряжения, градиенты давления и транспорт питательных веществ. В этой статье исследуются основы микрожидкостной технологии, ее преимущества для сосудистой тканевой инженерии, соображения дизайна, текущие приложения, проблемы и будущие направления.

Основы микрофлюидных систем

Микрофлюидика имеет дело с поведением, контролем и манипуляцией жидкостями, ограниченными каналами с размерами, обычно варьирующимися от десятков до сотен микрометров.В этом масштабе поток жидкости преимущественно ламинарный, характеризуется низкими числами Рейнольдса, то есть смешивание происходит в основном посредством диффузии, а не турбулентной конвекции. Этот режим ламинарного потока обеспечивает точный пространственно-временной контроль над растворимыми факторами, позиционированием клеток и механическими силами.

Большинство микрофлюидных устройств изготавливаются с использованием методов мягкой литографии с полидиметилсилоксаном (PDMS), прозрачным, газопроницаемым эластомером, который является биосовместимым и простым в формовании. Устройства PDMS могут быть связаны со стеклом или другими субстратами для формирования герметичных каналов. Альтернативные материалы включают термопласты, такие как поли(метилметакрилат) (PMMA) и циклический олефиновый сополимер (COC), которые обеспечивают большую химическую стойкость и более подходят для производства большого объема. Выбор материала зависит от конкретного применения, такого как долгосрочная культура клеток, исследования проницаемости лекарств или требования к визуализации в режиме реального времени.

Ключевые преимущества микрофлюидных систем включают в себя способность поддерживать устойчивый или пульсационный поток, генерировать точные профили напряжения сдвига, создавать градиенты концентрации и интегрировать несколько типов клеток в раздельно-отсекаемые геометрии. Эти особенности делают микрофлюидики особенно привлекательными для построения сосудистых моделей, которые имитируют микросреду in vivo.

Ключевые преимущества интеграции микрофлюидики в сосудистые модели

Интеграция микрофлюидных систем превращает модели сосудистых тканей из статических двумерных конструкций в динамические трехмерные платформы, которые захватывают важные аспекты сосудистой физиологии. Преимущества многогранны и непосредственно влияют на актуальность и полезность этих моделей для исследований и разработки лекарств.

Репликация гемодинамических сил

Эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды, постоянно подвергаются воздействию сдвига от текучей крови. Эта механическая сила имеет решающее значение для поддержания эндотелиальной функции, регулирования экспрессии генов и влияния на тонус сосудов и проницаемость. В статических культурах эндотелиальные клетки часто дифференцируются или теряют свою характерную морфологию. Микрофлюидные устройства могут применять контролируемый сдвигающий стресс путем регулирования скорости потока. Исследователи могут имитировать артериальные или венозные условия потока, в том числе пульсативную природу сердечного кровообращения, тем самым сохраняя эндотелиальный фенотип и функцию. Исследования показали, что эндотелиальные клетки, культивируемые при физиологическом сдвигающем стрессе, демонстрируют усиленное выравнивание, образование плотного соединения и производство оксида азота, ключевого вазодилататора.

Улучшенный обмен питательными веществами и отходами

В статических системах диффузия ограничивает подачу питательных веществ и удаление отходов, приводя к градиентам, которые могут напрягать клетки. Микрофлюидная перфузия обеспечивает непрерывное пополнение питательных веществ и кислорода при удалении метаболических отходов, создавая более стабильную и однородную среду. Это особенно важно для толстых трехмерных тканевых конструкций, где одной диффузии недостаточно. Поток также облегчает доставку растворимых сигнальных молекул, факторов роста или лекарств контролируемым пространственно-временным способом, что позволяет изучать концентрационно-зависимые эффекты на сосудистую стенку.

Усовершенствованная кокультура и сосудистая интеграция

Многие сосудистые модели требуют наличия нескольких типов клеток, таких как перициты, клетки гладкой мускулатуры или иммунные клетки, для точного воспроизведения структуры и функции стенок сосудов. Микрофлюидные платформы могут быть спроектированы с отдельными каналами или отсеками для формирования различных популяций клеток в близком аппозиции, что позволяет осуществлять паракриновую сигнализацию и взаимодействие клеток с клетками. Например, модель гематоэнцефалического барьера может включать микрососудистый канал, выстланный эндотелиальными клетками, прилегающими к каналу, содержащему астроциты и перициты, с пористой мембраной, разделяющей их. Способность отделять и перфузировать каждую область независимо значительно улучшает физиологическую значимость таких систем кокультуры.

Высокопроизводительные и параллельные анализы

Микрофлюидные устройства могут быть изготовлены с помощью нескольких параллельных каналов или массивов камер для культивирования, что позволяет одновременно тестировать различные условия (например, концентрации лекарств, скорости потока, типы клеток) на одном чипе. Эта высокая пропускная способность ускоряет экспериментирование при одновременном снижении потребления реагентов и требований к клеткам. Интеграция с автоматизированными системами обработки жидкости и визуализации дополнительно увеличивает пропускную способность, делая микрофлюидные сосудистые модели привлекательными для скрининговых библиотек кандидатов на лекарства или изучения отношений доза-реакция при сосудистых заболеваниях.

Проектирование и изготовление микрожидкостных сосудистых моделей

Эффективная конструкция микрожидкостной сосудистой модели требует тщательного рассмотрения геометрии канала, свойств материала, методов посева клеток и установки перфузии.Цель состоит в создании микросреды, которая тесно имитирует нативный сосуд, сохраняя при этом практичность для экспериментальных манипуляций и анализа.

Каналы геометрии и масштабирования

Размеры каналов должны быть выбраны для репликации размера целевых кровеносных сосудов. Для микрососудистых моделей ширина и высота каналов могут варьироваться от 50 до 300 мкм, в то время как более крупные артериальные модели могут использовать каналы 500 мкм или более. Форма поперечного сечения (прямоугольная, круговая или трапециевидная) влияет на профили потока и распределение напряжения сдвига. На этапе проектирования часто используются компьютерные модели динамики жидкости (CFD) для прогнозирования моделей потока, величин напряжения сдвига и времени пребывания. Многие конструкции включают бифуркации, сужения или изогнутые секции для имитации сосудистой геометрии in vivo и индуцируют сложные структуры потока, которые влияют на эндотелиальное поведение.

Выбор материала и обработка поверхности

PDMS остается наиболее широко используемым материалом благодаря оптической прозрачности, газопроницаемости и простоте изготовления. Однако PDMS является гидрофобным и имеет тенденцию адсорбировать малые гидрофобные молекулы, что может осложнить исследования лекарственных средств. Поверхностные обработки, такие как кислородная плазма, покрытие белками внеклеточного матрикса (например, фибронектин, коллаген, желатин) или применение полиэтиленгликоля (PEG), могут улучшить адгезию клеток и уменьшить неспецифическое связывание. Для анализа проницаемости лекарственных средств могут быть предпочтительными материалы с более низкой абсорбцией, такие как стекло или специфические термопласты. Выбор субстрата также влияет на качество визуализации, так как PDMS автофлуоресцирует на определенных длинах волн.

Сеяние клеток и эндотелиализация

Засев эндотелиальных клеток равномерно на стенках микроканала имеет решающее значение для формирования конфлуентного монослоя. Общие методы включают статическое посевное введение клеточной суспензии в канал и разрешение клеткам оседать, за которым следует перфузия для удаления неприцепных клеток. Некоторые конструкции используют поток, управляемый гравитацией, или центробежные силы для повышения эффективности посева. Для содействия адгезии клеток каналы предварительно покрыты матричными белками. После посева клетки обычно культивируют в статических условиях в течение нескольких часов для установления первоначального присоединения перед началом потока. Скорость потока затем постепенно увеличивается до желаемого напряжения сдвига, чтобы позволить клеткам адаптироваться.

Перфузия и контроль потока

Точный контроль потока жидкости достигается с помощью шприцевых насосов, перистальтических насосов или систем, приводимых в действие давлением. Шприцевые насосы обеспечивают стабильные скорости потока, подходящие для экспериментов с устойчивым состоянием, в то время как перистальтические насосы могут рециркулировать носители в замкнутом контуре. Системы, приводимые в действие давлением, обеспечивают более быстрое время отклика и могут генерировать более сложные профили потока, включая пульсативные формы волн. Вся установка часто помещается внутри инкубатора CO2 для поддержания температуры и pH, или устройство может быть спроектировано с интегрированными нагревательными элементами и резервуарами для носителей. Трубы и разъемы должны быть биосовместимыми и стерильными.

Интеграция датчиков и мониторинг

Передовые микрофлюидные сосудистые модели включают встроенные датчики для мониторинга в реальном времени таких параметров, как концентрация кислорода, рН, температура и электрическое импеданс. В устройство могут быть интегрированы электрохимические датчики, оптические волокна или флуоресцентные репортеры. Например, с помощью чувствительных к кислороду флуоресцентных красителей исследователи могут отображать градиенты гипоксии в конструкцию васкуляризованной ткани. В реальном времени визуализация морфологии клеток, сигнализация кальция или поглощение лекарств возможна благодаря оптической доступности микрофлюидных каналов.

Применение микрофлюидных сосудистых моделей

Улучшение функциональности микрожидкостных сосудистых моделей открыло новые возможности в фундаментальных исследованиях, разработке лекарств и персонализированной медицине.

Токсичность и проницаемость лекарств скрининг

Медикаментозная сосудистая токсичность является значительной проблемой в фармацевтическом развитии. Микрофлюидные модели кровеносных сосудов человека могут использоваться для оценки влияния соединений-кандидатов на жизнеспособность эндотелия, барьерную функцию и воспаление. Измеряя трансэндотелиальную электрическую стойкость (TEER) или утечку флуоресцентных индикаторов, исследователи могут количественно оценить изменения проницаемости сосудов в ответ на лекарства. Эти анализы более предиктивны для человеческих реакций, чем традиционные модели животных или культуры статических клеток.
Недавний обзор в Nature Reviews Drug Discovery подчеркивает потенциал микрофизиологических систем в оценке безопасности лекарств.

Ангиогенез и исследования сосудистого ремоделирования

Микрофлюидные устройства позволяют изучать ангиогенное прорастание под контролируемыми химическими и механическими градиентами. Включая гидрогелевые области, прилегающие к микроканалам, исследователи могут наблюдать, как эндотелиальные клетки вторгаются в 3D-матрицу в ответ на градиенты фактора роста, с визуализацией в реальном времени. Эти модели использовались для скрининга про- или антиангиогенных соединений и изучения роли напряжения сдвига потока в разветвлении сосудов и созревании.
В статье в Lab on a Chip описывается микрофлюидная платформа для изучения прорастания ангиогенеза под перфузией.

Моделирование заболеваний (атеросклероз, тромбоз, рак)

Сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, включают сложные взаимодействия между кровотоком, эндотелиальной дисфункцией и воспалительными клетками. Микрофлюидные модели могут воспроизводить стенотические геометрии, нарушенные области потока и накопление липидов для изучения образования и прогрессирования бляшек. Для исследования тромбоза микроканалы, покрытые эндотелиальными клетками, могут подвергаться воздействию факторов свертывания или богатой тромбами плазмы для исследования образования тромбов под потоком. В исследованиях рака микрофлюидные сосудистые модели используются для изучения экстравазации циркулирующих опухолевых клеток, роли сдвига в метастазировании и эффективности антиангиогенной терапии.

Персонализированная медицина и модели, ориентированные на пациента

Используя индуцированные пациентом плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) или эндотелиальные клетки из образцов крови, исследователи могут создавать персонализированные микрофлюидные сосудистые модели. Эти модели могут использоваться для тестирования индивидуальных реакций на лекарства, прогнозирования сосудистых побочных эффектов или изучения генетических вариантов, связанных с сосудистыми заболеваниями. Сочетание клеток пациента с микрофлюидной технологией представляет собой шаг к точной медицине, где лечение может быть адаптировано на основе уникальной сосудистой биологии пациента.

Проблемы и ограничения

Несмотря на свои обещания, современные модели микрофлюидных сосудов сталкиваются с рядом препятствий, которые необходимо устранить для более широкого внедрения и перевода.

Засорение и образование пузырьков воздуха

Малые размеры каналов склонны к засорению агрегатами клеток, мусором или осажденными солями. Воздушные пузырьки, введенные во время установки, могут препятствовать потоку и повредить клетки. Тщательная дегазация среды, использование пузырьковых ловушек и фильтрация могут смягчить эти проблемы, но они добавляют сложность экспериментальному рабочему процессу.

Единообразность покрытия клеток

Достижение конфлюентного и функционального эндотелиального монослоя по всей поверхности канала остается сложной задачей, особенно в сложных геометриях, таких как бифуркации или изогнутые сегменты. Неполное покрытие приводит к областям открытой матрицы, которые могут вызвать свертывание или неспецифическую адгезию. Изучаются улучшенные протоколы посева и методы поверхностного рисования.

Долгосрочная культурная стабильность

Поддержание жизнеспособных эндотелиальных культур в течение недель или месяцев требует непрерывной перфузии, стерильности и замены среды. Со временем PDMS может поглощать липиды и мелкие молекулы, изменяя состав среды. Фенотип клеток может дрейфовать, а ремоделирование внеклеточного матрикса может изменять свойства каналов. Разработка надежных долгосрочных протоколов культуры является активной областью исследований.

Масштабируемость и стандартизация

В то время как микрофлюидные устройства могут быть распараллелены, масштабирование до 96-луночных или 384-луночных форматов пластин для высокопроизводительного скрининга представляет инженерные проблемы. Стандартизация конструкций устройств, источников ячеек и протоколов необходима для обеспечения воспроизводимости в лабораториях. Инициативы, такие как программа Organ-on-a-Chip in Development (ORCHID), направлены на установление технических стандартов.
Критический обзор в Trends in Biotechnology обсуждает препятствия стандартизации для систем орган-на-чипе.

Интеграция с аналитическими инструментами

Мониторинг биомаркеров, метаболитов или секреции белка в режиме реального времени обычно требует датчиков на чипе или микрофлюидных соединений с внешними аналитическими инструментами. Интеграция этих компонентов без ущерба жизнеспособности клеток или функции устройства остается технически сложной. Достижения в микроэлектродных массивах, биосенсорах и миниатюрных интерфейсах масс-спектрометрии могут в конечном итоге преодолеть эти барьеры.

Будущие направления

Область микрофлюидных сосудистых моделей быстро развивается, и несколько новых тенденций могут улучшить функциональность и клиническую значимость.

Многоорганические платформы на чипе

Сосудистые структуры являются неотъемлемой частью многих систем органов. Будущие платформы могут соединять микрожидкостную сосудистую сеть с отсеками, представляющими печень, почки, сердце или мозг, создавая «тело на чипе». Такие системы позволили бы исследователям изучать системное распределение лекарств, метаболитные эффекты и межорганные перекрестные контакты в реалистичном физиологическом контексте. Сосудистый канал служит кровеносной основой этих интегрированных платформ.

Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и органоидов

Специфические для пациента иПСК могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки и другие типы сосудистых клеток, что позволяет персонализировать моделирование заболеваний и скрининг лекарств. Объединение клеток, полученных из ИПСК, с микрофлюидными устройствами позволяет создавать васкуляризированные органоиды, где перфузированная сосудистая сеть поддерживает рост специфических для органа тканей. Эта синергия может значительно улучшить зрелость и функциональность органоидов для трансплантации и тестирования лекарств.

Передовая визуализация и машинное обучение

Высокосодержание изображения в сочетании с алгоритмами машинного обучения может автоматически анализировать морфологию клеток, миграцию и целостность барьера с течением времени. Модели глубокого обучения могут прогнозировать эффекты лекарств на основе данных визуализации, ускоряя процесс скрининга. Также изучаются автоматические петли обратной связи, которые корректируют условия потока или концентрации лекарств на основе показаний датчиков в реальном времени, что позволяет использовать «умные» микрофлюидные системы.

Сосудистые ткани для регенеративной медицины

В конечном счете, микрофлюидные подходы могут способствовать изготовлению имплантируемых, васкуляризованных тканевых конструкций. Используя биосовместимые и биоразлагаемые материалы, исследователи могут создавать предварительно сформированные микрососудистые сети, которые могут быть засеяны клетками пациента, а затем хирургически имплантированы для восстановления кровотока в поврежденные ткани. В то время как все еще на ранних стадиях исследования, подтверждающие концепцию, показали, что такие конструкции могут интегрироваться с сосудистой системой хозяина на животных моделях.
Исследование в PNAS демонстрирует имплантацию микрофлюидного сосудистого каркаса, который поддерживает перфузию тканей in vivo.

Заключение

Интеграция микрофлюидных систем в модели сосудистых тканей принципиально улучшила способность воссоздавать динамическую трехмерную среду кровеносных сосудов in vitro. Обеспечивая точный контроль над потоком жидкости, сдвига стрессов, доставки питательных веществ и взаимодействия клеток с клетками, эти модели предлагают беспрецедентное понимание сосудистой биологии и патологии. Они служат мощными платформами для разработки лекарств, моделирования заболеваний и персонализированной медицины, а также закладывают основу для будущих применений в регенеративной медицине. Продолжение достижений в материаловедении, клеточной инженерии и системной интеграции еще больше повысит функциональность и доступность этих моделей, приближая нас к полностью человеко-представительным сосудистым платформам, которые могут заменить тестирование на животных и ускорить терапевтическое открытие.