Использование гидрогеля для имитации тканевой ткани Ecm в 3d культурах

Гидрогели как внеклеточная матрица имитируют в трехмерной клеточной культуре

Трехмерная (3D) клеточная культура стала важным инструментом в современных биомедицинских исследованиях, поскольку она повторяет ключевые аспекты микросреды in vivo. В основе этой революции лежат гидрогели — водораздутые полимерные сети, которые могут быть спроектированы для тесной имитации нативного внеклеточного матрикса (ECM). В этой статье рассматриваются принципы, типы и применения гидрогелей в качестве имитирующих ECM, обсуждаются их преимущества и текущие ограничения и освещаются новые стратегии, которые перемещают поле в сторону более физиологически релевантных моделей.

Внеклеточная матрица: динамический каркас

В живых тканях клетки встроены в ECM — сложную, трехмерную сеть белков, гликопротеинов и полисахаридов. ECM обеспечивает не только структурную поддержку, но и биохимические и механические сигналы, которые регулируют адгезию клеток, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживание. Ключевые компоненты включают коллаген, фибронектин, ламинин, эластин и гликозаминогликаны, такие как гиалуроновая кислота. ECM постоянно ремоделируется ферментами, такими как матричные металлопротеиназы (MMPs) и уникален для каждого типа ткани с точки зрения состава, жесткости и пористости.

Традиционные двумерные (2D) монослойные культуры вынуждают клетки на жесткий, плоский субстрат, который мало похож на эту естественную 3D-среду. Клетки на пластике или стекле демонстрируют аномальную морфологию, измененную экспрессию генов и потерю тканеспецифических функций. Гидрогели преодолевают эти ограничения, обеспечивая гидратированный 3D-каркас, который можно настроить в соответствии с физическими и химическими свойствами нативной ECM.

Что такое гидрогели?

Гидрогели представляют собой сшитые сети гидрофильных полимеров, которые могут поглощать и удерживать большое количество воды — часто 90-99% от их общего веса. Это высокое содержание воды придает им мягкую, тканеподобную консистенцию. Сшитки могут быть физическими (например, водородные связи, ионные взаимодействия, цепные запутанности) или химическими (ковалентные связи), и полученная сеть может быть разработана для деградации с течением времени или оставаться стабильной.

Поскольку гидрогели очень проницаемы для кислорода, питательных веществ и метаболических отходов, они могут поддерживать жизнеспособность клеток на протяжении всей 3D-конструкции. Они также могут быть функционализированы лигандами адгезии (например, пептидами RGD), факторами роста или другими биологически активными молекулами для направления поведения клеток. Эти особенности делают гидрогели наиболее широко используемым классом биоматериалов для построения 3D-культур клеток.

Типы гидрогелей, используемых для имитации нативной ECM

Естественные лягушки

Натуральные гидрогели получены из биологических источников и часто содержат внутренние биологически активные мотивы, которые распознают клетки.

• Коллаген I типа — самый распространенный белок у млекопитающих, широко используемый для 3D-культуры фибробластов, раковых клеток и стволовых клеток. Клетки могут сокращать и ремоделировать гели коллагена, делая их высокодинамичными.
• Гелатин — денатурированный коллаген, часто метакрилированный (GelMA) для фотоперекрестного сшивания.Гелатин сохраняет клеточно-связывающие мотивы и MMP-чувствительные сайты.
• Матригель — экстракт из подвала-мембраны саркомы мышей Энгельбрета-Холма-Шарма. В нём содержатся ламинин, коллаген IV, энтактин и факторы роста. Матригель широко используется для анализа органоидной культуры и ангиогенеза, но его происхождение животного происхождения вносит вариабельность от партии к партии.
• Гиалуроновая кислота (HA) — несульфатированный гликозаминогликан, обнаруженный во многих тканях. HA может быть химически модифицирован (например, метакрилированный HA) для образования стабильных гидрогелей.
• Альгинат — полисахарид из морских водорослей, образующий ионно сшитые гели с кальцием.Альгинат биосовместим, но не содержит сайты связывания клеток млекопитающих; он часто смешивается с другими биополимерами.
• Фибрин — образуется под действием тромбина на фибриноген.Гели Фибрина используются в заживлении ран и тканевой инженерии, и они естественным образом деградируют плазмином.

Природные гидрогели тесно пересказывают биохимическую сложность нативной ECM, но они страдают от ограниченной настраиваемости механических свойств и потенциальной иммуногенности или загрязнения.

Синтетические гидравлические

Синтетические гидрогели производятся из искусственных полимеров с четко определенной химией. Их свойства могут быть точно контролируемыми, и они обеспечивают превосходную воспроизводимость. Основные классы включают:

• Поли(этиленгликоль) (PEG) — наиболее распространенная платформа синтетического гидрогеля. PEG биологически инертна, поэтому она должна быть функционализирована с помощью адгезионных пептидов и сшитой с помощью химии щелчка, реакций тиол-эна или акрилатной фотополимеризации. PEG-гидрогели сильно настраиваются.
• Поли(виниловый спирт) (PVA) — могут быть сшиты с глютаральдегидом или через циклы замораживания-оттаивания. Гидрогели PVA механически прочны и используются для восстановления хряща и мягких тканей.
• Поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA) — исторически используемые для контактных линз; гидрогели PHEMA стабильны и могут быть модифицированы для 3D-культуры.
• Поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm) — термочувствительный полимер, который гелеобразует выше 32°C, позволяя собирать клеточный лист.
• Самосборочные пептиды — короткие синтетические пептиды, которые образуют β-листовые нановолокна в физиологических условиях, создавая гидрогель, имитирующий волокнистую структуру ECM.

Синтетические гидрогели устраняют многие неопределенности природных материалов, но им не хватает внутренней биоактивности, необходимой для многих типов клеток.Поэтому все большую популярность приобретают гибридные системы, сочетающие синтетические магистрали с биоактивной функционализацией.

Основные свойства гидрогеля для ECM-мимикрии

Механические свойства

Клетки чувствуют и реагируют на жесткость окружающей их матрицы через пути механотрансдукции. Гидрогели могут быть сформулированы для охвата широкого спектра эластичных модулей - от мягкой ткани мозга (~0,1-1 кПа) до жесткой кости или хряща (~10-40 кПа или даже выше). Например, гидрогели PEG могут быть настроены путем изменения концентрации полимера или плотности сшивания. Природные гидрогели, такие как коллаген, также демонстрируют поведение, усиливающее напряжение, которое характерно для многих нативных ECM.

Пористость и проницаемость

Идеальная ECM-мимика позволяет эффективно диффузировать кислород, питательные вещества и отходы. Размер пор, взаимосвязанность и размер сетки определяют скорость транспортировки. Синтетические гидрогели могут быть разработаны с контролируемой пористостью с использованием таких методов, как высушивание замораживания, выщелачивание соли или электроспиннинг. В некоторых случаях вводится макропористость (> 100 мкм), чтобы разрешить миграцию клеток и васкуляризацию.

Биоактивность и разлагаемость

Для поддержки клеточных функций гидрогели должны представлять адгезионные лиганды (например, RGD, YIGSR, IKVAV) и сайты связывания факторов роста. Они также должны быть деградируемыми - либо через ферменты, секретируемые клетками (MMP-чувствительные сшивки), либо путем гидролиза - так, чтобы клетки могли реконструировать матрицу, мигрировать и депонировать свою собственную ECM.

Вязкоупругость

Нативный ECM не является чисто эластичным; он проявляет вязкоупругое поведение — зависящее от времени расслабление и ползучесть. Недавние исследования показывают, что вязкоупругие гидрогели способствуют распространению и пролиферации клеток более эффективно, чем чисто эластичные гидрогели той же жесткости. Конструкция гидрогелей, имитирующих свойства расслабления стресса конкретных тканей, является активной областью исследований.

Преимущества гидрогеля перед 2D-культурой

• Физиологическая морфология: Клетки в 3D-гидрогелях принимают in vivo-подобные формы (например, округленные для мезенхимальных стволовых клеток, удлиненные для фибробластов), а не сплющенные, распространяющие морфологии, наблюдаемые на пластике.
• Улучшенная дифференциация: Стволовые клетки получают правильные механические и биохимические сигналы. Например, нейронные предшественники дифференцируются в нейроны более эффективно в мягких гидрогелях, чем в 2D.
• Взаимодействия клеток и матриц клеток: 3D культуры позволяют естественному контакту между клетками и с матрицей, что приводит к образованию прилипших соединений и разрывных соединений.
• Прогноз ответа на наркотики: Раковые клетки в 3D-гидрогелях демонстрируют большую устойчивость к химиотерапии по сравнению с 2D-монослоями, более точно имитируя чувствительность к лекарственным средствам in vivo.
• Долгосрочная культура: Гидрогели могут поддерживать жизнеспособные культуры в течение недель или месяцев, тогда как 2D-культуры часто становятся сольными и стареющими в течение нескольких дней.

Применение 3D-культур на основе гидрогеля

Тканевая инженерия и регенеративная медицина

Гидрогели используются в качестве каркасов для доставки клеток в поврежденные ткани. Например, для восстановления хряща используются инъекционные гидрогели, заполненные хондроцитами или мезенхимальными стволовыми клетками. Гидрогели на основе желатина, нагруженные остеогенными факторами, способствуют регенерации костей. Гидрогели Фибрина с дермальными фибробластами ускоряют заживление ран. Ключ заключается в том, чтобы сопоставить скорость деградации гидрогеля со скоростью образования новых тканей.

Органоидная и сфероидная культура

Стволовые клетки, засеянные в матригеле или синтетических гидрогелях, самоорганизуются в органоиды — миниатюрные органы, которые воспроизводят архитектуру и функцию тканей, таких как кишечник, мозг, печень и почки. Гидрогели обеспечивают физическую поддержку и биохимические градиенты, необходимые для самоорганизации. В недавней работе были разработаны полностью определенные синтетические гидрогели для органоидной культуры, уменьшая зависимость от плохо определенных экстрактов животных.

Моделирование заболеваний и скрининг лекарств

Опухолевые клетки, выращенные в гидрогелях, образуют опухолевые сфероиды или органоиды, полученные у пациентов, которые сохраняют гетерогенность исходного рака. Эти модели используются для высокопроизводительного скрининга лекарств и персонализированной медицины. Гидрогели также могут использоваться для имитации фиброзной ЭКМ таких заболеваний, как цирроз печени или легочный фиброз, предоставляя платформы для тестирования антифиброзных соединений.

Ангиогенез и исследования васкулизации

Эндотелиальные клетки, культивируемые в коллагеновых или фибриновых гидрогелях, образуют капиллярные сети при стимуляции ангиогенными факторами. Эти модели используются для изучения ангиогенеза опухоли, заживления ран и антиангиогенной эффективности препарата. Включение перицитов или клеток гладкой мышцы позволяет строить более зрелую, функциональную сосудистую систему.

Биопечать

Гидрогели, которые могут быть сшиты пространственно контролируемым образом (например, фото-сшиваемые GelMA или PEG-диакрилат), являются основными чернилами для 3D-биопечати на основе экструзии. Печатные конструкции могут содержать несколько типов клеток, расположенных в анатомически релевантных образцах. Задача остается для печати больших конструкций с достаточной механической стабильностью и васкуляризацией для поддержания жизнеспособности.

Для всестороннего обзора гидрогелевых применений см. Материалы для обзоров природы (2020) .

Ограничения и вызовы

Несмотря на успехи, гидрогели сталкиваются с несколькими препятствиями перед широко распространенным клиническим переводом:

• Механическая прочность: Большинство гидрогелей механически слабы и могут быть разорваны или сжаты при обработке. Разрабатываются гибридные гидрогели с взаимопроникающими сетями или армирование наночастицами.
• Контроль деградации: Природные гидрогели часто разрушаются слишком быстро или непредсказуемо. Синтетические гидрогели могут быть разработаны с контролируемыми скоростями деградации, но побочные продукты должны быть нетоксичными.
• Батч-вариабельность:] Матригель и другие гидрогели животного происхождения страдают от различий между лотом и лотом, что ставит под угрозу воспроизводимость.
• Имплантированные гидрогели могут провоцировать реакции инородного тела, включая воспаление, фиброз и инкапсуляцию. Стратегии смягчения этого включают использование ультранизких загрязняющих материалов и включение противовоспалительных агентов.
• Васкуларизация: Толстые конструкции (>200 мкм) требуют функционального кровоснабжения для предотвращения некроза.Преваскуляризация, микрофлюидика и включение ангиогенных факторов являются активными областями исследований.
• Масштабирование и воспроизводимость: Перевод гидрогеля лабораторного масштаба на продукт, соответствующий GMP, требует строгого контроля качества сырья, сшивания и посева клеток.