Использование синтетической биологии для разработки новых антибиотиков

Ограничения традиционного открытия

• Ре-открытие известных соединений:] Традиционный скрининг неоднократно идентифицирует одни и те же молекулы, поскольку большинство культивируемых микробов производят только часть своего генетического потенциала в лабораторных условиях.
• Узкое химическое разнообразие: леса натуральных продуктов широко эксплуатируются, и многие химические классы в настоящее время скомпрометированы широко распространенными механизмами устойчивости.
• Высокая стоимость и низкая пропускная способность: Работа крупномасштабных экранов ферментации и очистки дорогая и медленная, часто занимает годы от попадания до свинца.
• Развитие устойчивости: Даже новые молекулы, структурно похожие на существующие препараты, могут сталкиваться с перекрестной устойчивостью, сокращая их клиническую продолжительность жизни.

Синтетическая биология подходит к развитию антибиотиков

Синтетическая биология решает эти ограничения с лоб в лоб, позволяя рациональное проектирование, рефакторинг путей и оптимизация высокой пропускной способности. Вместо того, чтобы полагаться на случайный или грубый скрининг, исследователи могут проектировать организмы для производства новых соединений, активировать «загадочные» биосинтетические генные кластеры и даже создавать совершенно новые химические архитектуры. Следующие подразделы описывают наиболее важные подходы.

Инженерия Pathway и активация криптокластера

Большинство известных антибиотиков происходят из вторичных метаболических путей у бактерий (особенно ] Стрептомики и грибов. Секвенирование генома показало, что эти организмы содержат гораздо больше биосинтетических генных кластеров (BGC), чем они выражают в стандартных лабораторных условиях — часто называемых «тихими» или «загадочными» кластерами. Синтетическая биология предоставляет инструменты для пробуждения этих кластеров путем замены нативных промоторов сильными, индуцируемыми или путем рефакторинга целых кластеров и трансплантации их в хорошо характеризуемые организмы-хозяева, такие как Escherichia coli или Streptomyces coelicolor .

Например, открытие тейксобактина (обещающего клеточно-активного антибиотика) включало культивирование ранее не культивируемых почвенных бактерий, но синтетическая биология может сделать этот шаг дальше: синтезируя и рефакторинг BGC из метагеномной ДНК, исследователи могут получить доступ к химическому потенциалу микробов, которые вообще не могут быть выращены в лаборатории. Инженерия Pathway также позволяет создавать гибридные антибиотики, заменяя домены между поликетидными синтазами или нерибосомными пептидными синтетазами, производя молекулы с измененными структурами каркаса и улучшенной активностью.

Генный синтез и дизайн антимикробных пептидов De Novo

Вместо того, чтобы полагаться на естественные шаблоны, синтетическая биология может создавать совершенно новые антимикробные молекулы. Антимикробные пептиды (АМП) являются многообещающим классом: они короткие, амфипатические пептиды, которые разрушают бактериальные мембраны. Однако природные АМП часто имеют плохую стабильность, токсичность для клеток млекопитающих или высокие производственные затраты. Используя синтетическую биологию, исследователи могут проектировать АМП de novo , оптимизируя последовательности для заряда, гидрофобности и гелисити. Эти последовательности могут быть кодированы в синтетических генах и экспрессированы в инженерных хозяев продукции, таких как Pichia pastoris или E. coli .

Машинное обучение ускоряет этот процесс. Модели могут прогнозировать антимикробную активность, гемолиз и другие свойства пептидных последовательностей, а затем предлагать оптимизированные варианты. В одном поразительном примере ученые из Массачусетского технологического института использовали модель глубокого обучения для скрининга более 100 миллионов молекул и определили нового кандидата на антибиотик, галицина, который показал активность широкого спектра действия даже против лекарственно-устойчивых штаммов. В то время как галцин является небольшой молекулой, тот же подход был применен к открытию пептидов. Сочетание дизайна, управляемого ИИ, и производства синтетической биологии создает быстрый цикл для генерации потенциальных соединений.

Хост-инжиниринг для эффективного производства

Даже лучшие молекулы антибиотиков бесполезны, если они не могут быть изготовлены в масштабе и по разумной цене. Многие антибиотики натурального продукта являются сложными вторичными метаболитами, которые не могут быть химически синтезированы экономически; ферментация нативного производителя часто является медленной и низкоурожайной. Синтетическая биология решает эту проблему путем разработки надежных промышленных хозяев - обычно E. coli , Saccharomyces cerevisiae или Streptomyces - для получения желаемого соединения с высоким выходом.

Инженерия хозяина включает оптимизацию поставок прекурсоров, устранение конкурирующих метаболических путей и повышение толерантности к продукту. Например, производство артемизинина (противомалярийного) в дрожжах было знаковым достижением, и аналогичные стратегии теперь применяются к антибиотикам. Исследователи разработали E. coli для производства аналогов эритромицина, прекурсоров ванкомицина и даже новых β-лактамных антибиотиков путем объединения генов из разных организмов. Достижения в редактировании генома (CRISPR-Cas9, базовые редакторы) и метаболическом моделировании (модели геномного масштаба, анализ баланса потока) сделали инженерию хозяина более быстрой и предсказуемой.

Синтетическая биология без клеток для быстрого прототипирования

Возникает комплементарный подход к безклеточной синтетической биологии, которая использует экстракты из лизидных клеток (или очищенных ферментов) для проведения биохимических реакций вне живого организма. Системы без клеток обходят ограничения жизнеспособности клеток — токсичные промежуточные продукты не убивают хозяина, и оптимизация пути может быть сделана в течение нескольких часов, а не недель. Исследователи использовали бесклеточную экспрессию для быстрого тестирования комбинаций биосинтетических ферментов, выявления узких мест и производства небольших количеств антибиотиков-кандидатов для скрининга. После проверки оптимизированный путь может быть передан в живого хозяина для масштабированного производства. Этот трубопровод резко ускоряет цикл проектирования-создания-тестирования-обучения.

Ключевые истории успеха: синтетическая биология

Хотя многие усилия все еще находятся на стадии исследований, несколько заметных успехов демонстрируют силу подхода к синтетической биологии.

• Инженерные аналоги ванкомицина:] Исследователи из Университета Рокфеллера использовали синтетическую биологию для получения модифицированных форм ванкомицина, которые преодолевают резистентность. Изменяя пептидную основу и добавляя липидсвязывающие фрагменты, они создали соединения с мощной активностью против ванкомицинорезистентных энтерококков (VRE). Инженерные штаммы продуцировали сложную молекулу через рефакторированные биосинтетические пути.
• Малацидины: Эти кальций-зависимые антибиотики были обнаружены путем добычи метагеномной ДНК из образцов почвы. Биосинтетический генный кластер был идентифицирован, синтезирован и экспрессирован в гетерогенном хозяине, что дало новый класс антибиотиков, активных против MRSA и других грамположительных патогенов. Эта работа подчеркивает, как синтетическая биология открывает разнообразие натуральных продуктов без необходимости выращивания.
• Шасси стрептомицей для новых поликетид: Ученые разработали штамм «супер-хозяин» Стрептомицес, который экспрессирует >30 молчаливых BGC в контролируемых условиях, что приводит к открытию нескольких новых макролидных антибиотиков.Заменяя регуляторные элементы и экспрессируя активаторы, специфичные для пути, они активировали кластеры, которые никогда не экспрессировались в штамме дикого типа.
• De novo разработала антимикробные пептиды: Несколько групп использовали машинное обучение для разработки пептидов с широкой активностью спектра и низкой цитотоксичностью млекопитающих. Один такой пептид, получивший название «combi-1», был синтезирован генетически и экспрессирован в E. coli при выходе грамма на литр, демонстрируя масштабируемое производство.

Проблемы и этические соображения

Несмотря на свои обещания, открытие антибиотиков, основанных на синтетической биологии, сталкивается со значительными препятствиями.

• Технические проблемы: BGC могут быть очень большими (>100 кб), их трудно синтезировать точно, и часто требуются посттрансляционные модификации, которые не поддерживаются общими гетерогенными хостами. Неоднородность ферментов и доступность субстрата могут ограничивать выходы. Многие перспективные лиды никогда не выходят за рамки миллиграммовой шкалы.
• Эволюция устойчивости:] Даже новые антибиотики могут быть преодолены бактериальной эволюцией в течение нескольких лет.Синтетический биологический трубопровод должен постоянно питаться новыми лидами, и стратегии, которые замедляют резистентность, такие как нацеливание на несколько участков или использование адъювантных комбинаций, должны быть интегрированы на ранней стадии.
• Регулятивные и безопасные проблемы: Генетически модифицированные производственные организмы могут вызывать проблемы биобезопасности, особенно если они содержат гены токсичных соединений или если они попадают в окружающую среду. Требуются строгие сдерживающие и выключающие конструкции. Регулирующие пути для антибиотиков, производимых синтетической биологией, могут быть неясными, поскольку регулирующие органы имеют ограниченный опыт работы с продуктами, изготовленными с помощью обширного генетического рефакторинга.
• Экономическая жизнеспособность: затраты на разработку нового антибиотика с помощью синтетической биологии могут быть сопоставимы с традиционными методами — часто более 1 миллиарда долларов — и рыночная доходность неопределенна. Для обеспечения устойчивости исследований и разработок антибиотиков необходимы новые экономические модели, такие как стимулы на основе подписки или стимулирование.

Этические соображения также включают справедливый доступ: если синтетическая биология позволяет дешево производить сложные антибиотики, распределение не должно ограничиваться мотивами прибыли, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода, где показатели устойчивости являются самыми высокими. 5-летний план действий по УПП Великобритании признает необходимость инноваций как в открытии, так и в доступе.

Будущие перспективы: ИИ, автоматизация и персонализированная терапия

В следующем десятилетии синтетическая биология, вероятно, будет еще более тесно сливаться с искусственным интеллектом и лабораторной автоматизацией. ИИ может предсказать, какие BGC, скорее всего, дадут новые антибиотики, разработать варианты ферментов с улучшенной активностью и предложить «части» (промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы), которые максимизируют выход пути. Автоматизированные роботизированные литейные заводы могут тестировать тысячи генетических конструкций в неделю, возвращая данные для обучения прогнозным моделям. Эта система замкнутого цикла может резко сжать временную шкалу от идеи до клинического кандидата.

Персонализированная антибиотикотерапия также может стать осуществимой. Синтетическая биология может быть использована для производства специфических для пациента бактериофагов, которые доставляют гены, кодирующие антимикробные пептиды, или для разработки пробиотиков, которые секретируют антибиотики in situ в месте инфекции. Хотя эти подходы являются спекулятивными, ранние испытания с инженерными фаговыми коктейлями показывают перспективу против инфекций, связанных с биопленкой.

Еще одним рубежом является синтез совершенно новых классов молекул, не ограниченных природными каркасами. Ученые уже создали "ксено-нуклеиновые кислоты" (ХНА) и "ксено-пептиды", которые не распознаются существующими механизмами резистентности. Если синтетическая биология может производить эти молекулы в масштабе, они могут обеспечить долгосрочные решения.

В целом, синтетическая биология не является волшебной пулей, но, возможно, это самый мощный инструментарий, когда-либо собранный для открытия антибиотиков. Объединив рациональный дизайн с обширным химическим пространством, доступным через биологические системы, он предлагает реалистичный путь, чтобы опередить устойчивость к противомикробным препаратам. Прогресс, достигнутый за последние десять лет - от пробуждения молчаливых генных кластеров до разработки искусственных пептидов - должен дать мировому сообществу здравоохранения уверенность в том, что новые антибиотики не только возможны, но и могут быть разработаны систематически.