Использование таленов и Zfns в современных генетических исследованиях

Современные генетические исследования вступили в трансформационную эру, обусловленную разработкой точных инструментов редактирования генов. Среди новаторских технологий TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) и ZFN (Zinc Finger Nucleases) выделяются как основополагающие платформы, которые позволили целенаправленной модификации ДНК задолго до революции CRISPR. Эти инженерные белки позволяют ученым вводить двухцепочечные разрывы в определенных геномных местах, используя врожденные пути восстановления клетки - негомологичный конечный присоединение (NHEJ) или гомологический ремонт (HDR) - для достижения нокаута генов, коррекции или вставки. Их влияние распространяется на медицину, сельское хозяйство и фундаментальные биологические исследования, и они остаются незаменимыми в приложениях, где требуется высокая специфичность или небольшие целевые последовательности.

Понимание механизмов TALEN и ZFN

Нуклеазы цинковых пальцев: модульное распознавание ДНК

ZFN были первыми широко принятыми программируемыми нуклеазами, впервые описанными в середине 1990-х годов. Каждый ZFN содержит ДНК-связывающий домен, собранный из белков цинкового пальца, и домен расщепления ДНК, полученный из FokI рестрикционной эндонуклеазы. Отдельные модули цинкового пальца обычно распознают трехнуклеотидную последовательность. Связывая несколько пальцев в тандеме, исследователи могут нацеливать последовательности в диапазоне от 9 до 18 пар оснований. Поскольку FokI должны димеризоваться для разрезания ДНК, два ZFN предназначены для связывания противоположных цепей целевого участка, расположенных так, что их домены расщепления объединяются по области прокладки. Это требование к гетеродимеризации значительно снижает активность за пределами цели.

Проектирование и сборка цинковых пальцевых массивов может быть технически сложной из-за контекстно-зависимого сходства — на распознавание цинкового пальца могут влиять соседние пальцы. Тем не менее, такие методы, как OPEN (Oligomerized Pool Engineering) и контекстно-зависимая сборка, улучшили предсказуемость. ZFN использовались для создания линий клеток нокаута, генерации трансгенных моделей животных и коррекции мутаций, вызывающих заболевания, в ранних клинических испытаниях.

Активатор транскрипции-подобные эффекторные нуклеазы: однонуклеотидная специфичность

TALEN появились примерно в 2009-2010 годах в качестве альтернативы с более простыми правилами проектирования. Их ДНК-связывающий домен происходит от активатор-транскрипционных эффекторов (TALE), белков, секретируемых растительным патогеном Xanthomonas . Каждый модуль TALE распознает точно один нуклеотид, определяемый двумя гипервариабельными аминокислотными остатками — известными как повторяющиеся переменные дирезиду (RVD). Наиболее распространенными RVD-нуклеотидными парами являются NI для аденина, HD для цитозина, NG для тимина и NN для гуанина. Упорядочение этих модулей позволяет TALEN нацеливаться практически на любую последовательность ДНК.

TALEN также используют домен расщепления FokI и требуют парного связывания для резки. Сборка повторных массивов TALE может быть достигнута с помощью клонирования Золотых Ворот или синтеза твердой фазы. TALEN обычно проявляют более высокую специфичность, чем ZFN, и более низкую токсичность в клетках, хотя их большой размер (~3 кб на мономер) может быть ограничением для доставки вирусных векторов. Тем не менее, они успешно применяются в клеточных линиях рыбок данио, крыс, свиней и человека, а также в нескольких доклинических исследованиях генной терапии.

Историческое развитие и вехи

Путешествие инженерных нуклеаз началось с открытия белков цинковых пальцев в конце 1980-х годов. В 1996 году Чандрасегаран и его коллеги слили домен три-цинк-пальца с FokIFokI, создав первый ZFN. Этот прорыв позволил целенаправленно редактировать геном в Drosophila и позже в клетках человека. К 2005 году ZFN были использованы для модификации гена CCR5, чтобы придать резистентность к ВИЧ, концепция, которая позже вошла в клинические испытания. В исследовании SB-728-T (Sangamo Therapeutics) использовались ZFN для разрушения CCR5 в Т-клетках пациентов, демонстрируя безопасность и долгосрочную приживку.

Технология TALEN быстро развивалась после структурного выяснения белков TALE в 2007 году. В течение трех лет несколько групп сообщили о функциональных TALEN для редактирования генов в дрожжах, растениях и клетках человека. Их простота понизила барьер для академических лабораторий для принятия редактирования генома, вызвав волну открытий. К 2012 году TALEN были использованы для создания первых генно-отредактированных свиней для моделирования заболеваний и исследования ксенотрансплантации. Всесторонний обзор Ким и Ким (2014) в Nature Reviews Genetics подробно описывает параллельную эволюцию обеих технологий.

Приложения в современных исследованиях

Медицинские исследования и генная терапия

ZFN и TALENs имеют продвинутую генную терапию моногенных расстройств. При серповидноклеточной болезни и бета-талассемии ZFN, нацеленные на BCL11A, энхансер эритроида реактивирует экспрессию гемоглобина плода. Фаза 1/2 клинического испытания (NCT03282656) с использованием ZFN для редактирования гемопоэтических стволовых клеток ex vivo показала устойчивое улучшение гемоглобина. TALEN были использованы для коррекции гена IL2RG в клетках пациентов с X-связанным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID-X1) с исправленными клетками, демонстрирующими функциональное восстановление в моделях мышей. В онкологии обе нуклеазы были использованы для разработки химерных антигенных рецепторов (CAR)-T клеток с улучшенной персистентностью и уменьшенным истощением. Например, TALEN-опосредованное нарушение [[FLT:

Сельскохозяйственная биотехнология

В улучшении урожая TALEN и ZFN использовались для создания устойчивых к гербицидам и болезням сортов. Первый продаваемый TALEN-отредактированный урожай — соя с улучшенным профилем масла — был разработан Calyxt и выпущен в 2019 году. ZFNs были применены для повышения урожайности риса путем выбивания отрицательных регуляторов размера зерна. Высокая специфичность этих нуклеаз снижает непреднамеренные геномные изменения, что выгодно для нормативного принятия. Подробный анализ Юнга и Сандера (2013) в Природная биотехнология рассматривает применение TALEN в геномной инженерии растений.

Функциональная геномика и модельные организмы

Обе платформы позволили систематические исследования нокаутов генов у видов, где эмбриональные стволовые клетки были недоступны. У рыбок данио TALEN были использованы для создания > 200 целевых мутантов в рамках одного консорциума, раскрывая функции генов в развитии и болезни. У крыс ZFN нарушили опухолевый супрессор p53 для создания моделей рака. Способность генерировать точные точечные мутации через HDR с использованием одноцепочечных олигонуклеотидных доноров расширила репертуар моделей детонации для нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний. Исследователи также объединили TALEN с системами условной экспрессии для достижения тканеспецифического редактирования.

Сильные стороны и ограничения по сравнению с CRISPR-Cas9

Появление CRISPR-Cas9 (2012) предложило более простой дизайн, способность мультиплексирования и более высокую эффективность, что привело к его широкому распространению. Однако TALEN и ZFN сохраняют уникальные преимущества. Их распознавание ДНК на основе белка не зависит от направляющей РНК, устраняя риск РНК-опосредованных нецелевых эффектов. Кроме того, ZFN и TALEN проявляют более высокую специфичность для последовательностей с повторяющимися или богатыми GC областями, которые бросают вызов нацеливанию CRISPR. Большие размеры этих конструкций (~ 4-10 кб) могут быть упакованы в адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы с трудом, но оптимизируются стратегии с двумя векторами и мини-TALEN конструкции.

Основным ограничением является стоимость и труд, необходимые для разработки новых ZFN или TALEN для каждой цели. В то время как CRISPR требует только перепроектирования последовательности руководства 20 б.п., синтез ZFN и TALEN требует сборки и проверки домена белка. Расщепление нецелевого домена также вызывает озабоченность; массивы цинковых пальцев могут терпеть несоответствия, и TALEN могут сокращаться на частичных целевых участках. Комплексное профилирование нецелевого типа с использованием таких методов, как Guide-Seq или CIRCLE-Seq, имеет важное значение для клинического перевода. Обзор 2017 года в Тенденции в биотехнологии контрастирует с профилями точности и доставки этих трех нуклеаз.

Будущие направления и текущие улучшения

Текущие исследования направлены на повышение эффективности и безопасности TALEN и ZFN при одновременном снижении производственных затрат. Достижения в области белковой инженерии привели к тому, что ZFN стали более термостабильными и менее цитотоксичными. Структурная редизайн FokI (например, ELD-KKKR и Sharkey) повышает специфичность димеризации и каталитической активности. Для TALEN алгоритмы машинного обучения теперь предсказывают оптимальные комбинации RVD для сложных целей, а высокопроизводительное клонирование золотых ворот позволяет изготавливать массивы за один день.

Доставка остается узким местом для применения in vivo. Липидные наночастицы и аденоассоциированные вирусные векторы совершенствуются для гемопоэтических стволовых клеток и гепатоцитов. Переходная доставка белков ZFN/TALEN (а не ДНК) снижает длительную экспрессию нуклеазы и нецелевые события. В сельском хозяйстве TALEN используются для разработки цисгенных культур, которые проникают в естественные аллели без чужеродной ДНК. Регулятивный ландшафт может благоприятствовать этим инструментам pre-CRISPR из-за их установленного рекорда безопасности и прецедента для одобрения на рынке.

Наконец, комбинация TALEN или ZFN с базовым редактированием или простым редактированием — технологии, которые полагаются на никазы, а не на двухцепочечные разрывы — может расширить их полезность. Например, цитидиндеаминаза, связанная с Zn-фингером, может выполнять целевое преобразование базы без двухцепочечных разрывов. Опубликованное клиническое исследование на основе ZFN CCR5 редактирование [[Tebas et al., 2014, New England Journal of Medicine иллюстрирует терапевтический потенциал, который продолжает стимулировать инвестиции в эти классические платформы.

В заключение, ТАЛЕНы и ZFN остаются жизненно важными в арсенале инструментов для генетических исследований. Их отличительные свойства - модульное распознавание ДНК, высокая специфичность и установленная безопасность - делают их незаменимыми для определенных применений, особенно когда инструменты на основе РНК непригодны. По мере того, как область движется к точной медицине и устойчивому сельскому хозяйству, эти новаторские нуклеазы будут продолжать катализировать открытия, которые улучшают здоровье человека и продовольственную безопасность.