Новые технологии биореакторов для моделей тканей печени в тестировании лекарств

Введение: Печень как бутылочное горлышко для разработки лекарств

Наркотическая травма печени (DILI) остается ведущей причиной прекращения клинических испытаний и отмены лекарств после выхода на рынок. Высокий уровень отказов препаратов-кандидатов из-за гепатотоксичности - несмотря на прохождение доклинических исследований на животных - подчеркивает критический трансляционный разрыв, который стоит фармацевтической промышленности миллиарды ежегодно. Эта постоянная проблема ускорила разработку сложных моделей печени человека, предназначенных для прогнозирования человеческих реакций с более высокой точностью, чем традиционные системы.

Сложная архитектура печени и метаболический механизм исключительно трудно реплицировать вне тела. Стандартные двумерные (2D) монослойные культуры не в состоянии поддерживать дифференцированный фенотип первичных гепатоцитов человека (PHH), что приводит к быстрой потере активности ферментов цитохрома P450 (CYP), нарушенной полярности и отсутствию функции желчных каналов. Аналогичным образом, модели на животных часто не в состоянии воспроизвести специфический для человека метаболизм лекарств и идиосинкразический DILI. Эти биологические разрывы привели к интенсивным инновациям в трехмерных (3D) системах культуры, поддерживаемых передовыми биореакторными платформами - коллективно называемыми микрофизиологическими системами (MPS). Эти новые технологии направлены на преодоление разрыва между простой культурой клеток и сложной физиологией человека, обеспечивая более прогностические платформы для тестирования лекарств и моделирования заболеваний.

В этой статье подробно рассматриваются новые технологии биореакторов, которые меняют моделирование тканей печени для фармацевтических исследований. В ней исследуются инженерные принципы, лежащие в основе этих систем, их биологическая валидация, конкретные применения в открытии лекарств, а также нормативные и технические проблемы, которые остаются на пути к широкому распространению.

Физиологический императив: репликация печеночной микросреды

Печень — высокоорганизованный орган, состоящий из повторяющихся функциональных единиц, называемых дольками. В каждой дольке гепатоциты расположены в шнурах, излучаемых из центральной вены, создавая отдельные зоны оксигенации, воздействия питательных веществ и метаболической функции. Эта пространственная гетерогенность имеет решающее значение для метаболизма и детоксикации зонированных лекарственных средств. Помимо гепатоцитов печень содержит непаренхиматозные клетки (NPC), включая клетки Купфера (резидентные макрофаги), клетки печени синусоидальных эндотелий (LSEC) и билиарные эпителиальные клетки. Эти клетки активно взаимодействуют с гепатоцитами, влияя на их функцию и реакцию на повреждение.

Воспроизведение этой сложной, динамичной экосистемы в блюде требует не только правильных клеток, но и точного контроля над клеточной микросредой, в том числе:

Традиционные 2D монокультуры терпят неудачу на всех этих фронтах. ПГН, покрытые коллагеном, быстро дедифференцируются, теряя производство CYP3A4 и альбумина в течение 48-72 часов. Модели крыс и собак, хотя и полезны для острой токсичности, часто неправильно предсказывают DILI человека из-за различий в транспортерах, метаболических путях и иммунных реакциях. Эти фундаментальные ограничения создали сильный толчок к 3D-биореакторным системам, которые могут поддерживать функциональную ткань печени человека в физиологически соответствующей среде.

Специфическая токсикология и потребность в человеческих моделях

Ограничения моделей на животных ярко иллюстрируются такими препаратами, как троглитазон, антидиабетическое средство, выведенное с рынка из-за тяжелой DILI у людей, несмотря на отсутствие значительной токсичности в доклинических исследованиях на животных. И наоборот, такие препараты, как фиалуридин, вызывали летальную гепатотоксичность у людей, которая не была предсказана моделями на грызунах, собаках или обезьянах. Эти неудачи подчеркивают критическую потребность в моделях печени на основе человека. Новые технологии биореакторов решают эту проблему, используя первичные гепатоциты человека, гепатоциты, полученные из iPSC, или срезы печени, поддерживаемые в системах, которые лучше сохраняют их родной фенотип и функцию.

Основные инженерные принципы современных биореакторов печени

Конструкция современных биореакторов печени регулируется набором основных инженерных принципов, направленных на преодоление ограничений статической культуры, которые диктуют выбор геометрии реактора, режима потока и интеграции датчиков.

Перфузия и массовый перенос

Статические 2D культуры полагаются на пассивную диффузию, которая недостаточна для 3D-конструкций толще 100-200 микрометров. Перфузия - активный поток культуральной среды через или вокруг ткани - имеет важное значение для доставки питательных веществ и удаления отходов в более крупных конструкциях. Микрожидкостные биореакторы достигают этого посредством точно контролируемого ламинарного потока в каналах, в то время как 3D-перфузионные биореакторы используют поток, управляемый насосом, для циркуляции среды через пористые каркасы или пучки полых волокон. Скорость потока должна быть тщательно откалибрована, чтобы обеспечить достаточную передачу массы без генерирования напряжения сдвига, которое повреждает гепатоциты. Типичные напряжения сдвига в синусоидах печени варьируются от 0,05 до 0,5 дина / см2, диапазон, который повторяют многие современные системы.

Кислородирование

Гепатоциты обладают высокой метаболической активностью и высокими показателями потребления кислорода. В естественных условиях печень получает двойное кровоснабжение (портальная вена и печеночная артерия), что обеспечивает высокое напряжение кислорода в перипортальной зоне. В биореакторе in vitro in vitro кислород должен подаваться эффективно для предотвращения гипоксических ядер. Многие системы включают кислородопроницаемые мембраны или прямую оксигенацию среды для поддержания физиологических градиентов кислорода. Продвинутые биореакторы используют встроенные датчики кислорода для динамического мониторинга и регулирования кислородного напряжения, имитируя зонирование, наблюдаемое в нативных дольках печени.

Скаффолдинг и внеклеточная матрица

ECM обеспечивает структурную поддержку и биохимические сигналы, которые регулируют адгезию клеток, миграцию, дифференцировку и функцию. В конструкциях биореакторов используются различные стратегии лесов:

  • Природные гидрогели: Коллаген I, Матригель и децеллюляризованная ECM печени, которые обеспечивают нативные биохимические сигналы.
  • Синтетические полимеры: Флажки на основе PCL, PLGA и PEG, которые обеспечивают настраиваемые механические свойства и скорость деградации.
  • Децеллюляризованные органные каркасы: Целые печени лишены клеточного содержания, оставляя за собой родную архитектуру ECM и сосудистую сеть.
  • Подходы без каркасов: Самосборочные сфероиды или органоиды, которые производят свой собственный ECM.

Выбор каркаса значительно влияет на морфологию тканей, полярность и долгосрочную стабильность и является важной переменной в конструкции биореактора.

Ведущие биореакторные платформы для ливератканой инженерии

Появилось несколько различных платформ биореакторов, каждая из которых обладает уникальными преимуществами, адаптированными к конкретным применениям в тестировании лекарств, моделировании заболеваний и регенеративной медицине.

Микрожидкостные биореакторы (Liver-on-a-Chip)

Микрожидкостные биореакторы, часто называемые печеночными платформами, используют методы микрофабрикации для создания каналов и камер в масштабе от десятков до сотен микрометров. Эти системы обеспечивают точный контроль потока жидкости, напряжения сдвига и химических градиентов. Ключевые особенности включают:

  • Эндотелиализованные каналы: Микроканалы, выстланные синусоидальными эндотелиальными клетками печени (LSEC), которые отделяют отсек гепатоцитов от проточной среды, имитируя пространство Disse.
  • Мембранная интеграция: Пористые мембраны разделяют паренхиматозное и сосудистое отсеки, что позволяет осуществлять кокультурную и апикально-базальную поляризацию.
  • Мультиорганная интеграция: Печень на чипе может быть подключена к чипам, представляющим микросреду кишечника, почек или опухоли, для изучения метаболизма и токсичности между органами.

Ярким примером является Emulate Liver-Chip, двухканальное микрофлюидное устройство, которое воссоздает синусоидальный интерфейс печени. Эта платформа, как было показано, поддерживает жизнеспособность и функцию PHH в течение более 28 дней и точно прогнозирует DILI, вызванный препаратами с специфической для вида токсичностью, такими как фиалуридин. Система воспроизводит механические силы и поток жидкости, которые имеют решающее значение для поддержания фенестраций LSEC и полярности гепатоцитов. Узнайте больше о платформе Emulate Liver-Chip здесь .

3D-биореакторы перфузии и платформы на основе лесов

3D-перфузионные биореакторы используют поток, управляемый насосом, для перфузии среды через трехмерные каркасы, засеянные клетками печени. Эти системы предназначены для поддержки более крупных тканевых конструкций (миллиметры до сантиметров в толщину) и часто используются для более длительных периодов культивирования и более высокого скрининга пропускной способности. Ведущей коммерческой системой является платформа CN Bio PhysioMimix, которая использует запатентованные каркасы и микрожидкостную пластину потока для культивирования первичных гепатоцитов человека и NPC в 3D. Система поддерживает как одиночные, так и многотонкие форматы, что позволяет проводить исследования доза-реакция и эксперименты с хроническим воздействием.

Платформа PhysioMimix была широко проверена для скрининга DILI, включая обнаружение клинически значимых холестатических и стеатозных соединений. Она также поддерживает совместное культивирование с клетками Купфера и звездчатыми клетками, позволяя моделировать воспалительно-опосредованную гепатотоксичность и фибротические реакции. Способность платформы поддерживать функциональную активность CYP и экспрессию транспортера в течение нескольких недель делает ее пригодной для исследований токсичности повторных доз, которые невозможны в обычных 2D-системах. Исследуйте платформу CN Bio PhysioMimix и ее приложения .

3D-биопечать и биоискусственные устройства для печени

Биопечать предлагает возможность откладывать клетки, гидрогели и факторы роста слой за слоем для создания сложных пространственно организованных структур ткани печени.Эта технология обеспечивает беспрецедентный контроль над тканевой архитектурой, позволяя создавать сосудистые сети, зональные градиенты и гетерогенные клеточные распределения, которые близко имитируют нативную структуру печени.

Такие компании, как Organovo, впервые разработали биопечать тканей печени человека для тестирования токсичности лекарств. Их 3D-биопечатные конструкции печени поддерживают жизнеспособность, синтезируют альбумин, производят мочевину и экспрессируют ферменты CYP450 в течение более 40 дней. Эти конструкции использовались для обнаружения гепатотоксичности соединений, которые пропускаются 2D-культурами и моделями на животных. Помимо тестирования лекарств, биопечать обещает создание имплантируемых тканевых трансплантатов для регенеративной медицины, хотя значительные проблемы остаются в расширении до клинически значимых размеров и включающих полную васкуляризацию. Visit Organovo для обновлений 3D-биопечатных тканей печени .

Биореакторы приостановки для масштабируемого производства органоидов и сфероидов

Для высокопроизводительного скрининга и крупномасштабного производства органоидов печени биореакторы суспензии предлагают экономически эффективное и масштабируемое решение. В этих системах используется мягкое возбуждение (шпиннерные колбы или вращающиеся стеночные сосуды) для удержания клеток в суспензии, способствующее самоагрегации в сфероиды или органоиды. Они не полагаются на экзогенные каркасы, что делает их относительно простыми в настройке и масштабировании.

Биореакторы колбы спиннера использовались для генерации тысяч однородных сфероидов печени из первичных гепатоцитов человека, iHeps или линий печеночных клеток. Эти сфероиды демонстрируют улучшенную метаболическую функцию и долговечность по сравнению с 2D-культурами. При отсутствии точного микроэкологического контроля микрофлюидных чипов биореакторы суспензии превосходят по производству репликаций тканей для крупномасштабных скрининговых кампаний. Они особенно ценны для изучения стеатоза, холестаз и общей цитотоксичности в формате средней пропускной способности.

Валидация и применение в трубопроводе обнаружения наркотиков

Истинным испытанием любой новой технологии является ее способность предоставлять действенные, релевантные для перевода данные. Модели биореакторов печени были проверены на основе растущей библиотеки эталонных соединений и применяются по всему трубопроводу для обнаружения лекарств.

Скрининг повреждений печени (DILI)

Первичное применение этих систем - обнаружение DILI. Микрофлюидные и 3D перфузионные платформы продемонстрировали способность различать безопасные препараты и те, которые, как известно, вызывают DILI с высокой чувствительностью и специфичностью. Они особенно эффективны при обнаружении холестатического DILI (например, хлорпромазина, бозентана) и стеатозного DILI (например, амиодарона, тамоксифена), которые, как известно, трудно моделировать в стандартных культурах. Способность поддерживать функцию тканей в течение длительных периодов позволяет проводить исследования хронического воздействия, которые имитируют клинические схемы дозирования, выявляя токсичность, которая может появиться только через дни или недели лечения.

Моделирование заболеваний: НАЖБП, НАСГ и вирусный гепатит

Помимо токсичности, биореакторы печени являются мощными инструментами для моделирования заболеваний. Питаясь клетками коктейлем свободных жирных кислот и фруктозы, исследователи могут индуцировать стеатоз, воспаление и фиброз — признаки неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и неалкогольного стеатогепатита (NASH). Совместная культура с клетками Купфера и звездчатыми клетками позволяет моделировать воспалительные и фиброзные каскады, обеспечивая платформу для тестирования анти-NASH терапии.

Аналогичным образом, системы печени на чипе использовались для моделирования вирусной инфекции гепатита В и С, поскольку эти вирусы требуют поляризованных гепатоцитов и специфических механизмов поглощения, которые отсутствуют в 2D-культурах. Эти модели инфекции бесценны для изучения вирусных жизненных циклов и тестирования противовирусных соединений в контексте, соответствующем человеку.

Метаболизм наркотиков и взаимодействие наркотиков (DDI)

Устойчивая экспрессия ферментов CYP450 и ферментов II фазы, конъюгирующих в биореакторно-культурированной ткани печени, позволяет проводить детальные исследования метаболизма лекарственных средств и DDI. Микрофлюидные системы с интегрированной масс-спектрометрией могут контролировать метаболический поток в режиме реального времени, предоставляя информацию о метаболической стабильности, клиренсе и образовании реактивных метаболитов. Эта способность имеет решающее значение для оптимизации соединений свинца и предотвращения истощения на поздней стадии из-за метаболических обязательств.

Точная медицина и модели, полученные от пациентов

Интеграция клеток, полученных от пациентов, - либо из биопсии печени, либо из ИПСК - в платформы биореакторов открывает двери для точной медицины. Модели печени на чипе для пациентов могут использоваться для прогнозирования индивидуальной восприимчивости к токсичности лекарств или для проверки эффективности терапевтических схем лечения заболеваний печени. Этот подход имеет особое значение для онкологии, где полученные пациентом опухолевые органоиды могут быть протестированы против панели химиотерапевтических препаратов для руководства решениями о лечении.

Сравнительные преимущества и количественные показатели

Переход от 2D-систем к 3D-биореакторам поддерживается количественными улучшениями ключевых функциональных показателей.

Metric 2D Monolayer 3D Bioreactor (Microfluidic/Perfusion)
CYP3A4 Activity Low (<5% in vivo) 50-80% in vivo (maintained 28+ days)
Albumin Secretion Declines within 72 hours Stable for weeks
Bile Canaliculi Absent Functional networks present
Urea Production Low and declining Physiological levels maintained
Long-term Viability 5-7 days 28+ days
DILI Sensitivity Low (high false negative rate) High (70-90% sensitivity)

Эти количественные преимущества напрямую приводят к лучшей прогнозной мощности для результатов деятельности человека. Однако важно отметить, что ни одна система не идеальна для каждого применения. Выбор платформы биореактора зависит от конкретного биологического вопроса, требуемой пропускной способности и имеющихся ресурсов.

Текущие ограничения и инженерные узлы

Несмотря на свой потенциал трансформации, новые технологии биореакторов сталкиваются с серьезными проблемами, которые ограничивают их широкое распространение.

Воспроизводимость и стандартизация

Изменчивость в источнике клеток (первичный против iPSC), состав каркаса и работа биореактора затрудняет стандартизацию протоколов в лабораториях. Отсутствие универсальных стандартов для характеристики зрелости и функции тканей усложняет сравнение результатов между различными платформами. Усилия сообщества, такие как возглавляемые FDA и Европейским обществом орган-на-чипе (EUROoCS), направлены на установление руководящих принципов надлежащей клеточной культуры (GCCP), специфичных для MPS, но широкое внедрение остается в стадии разработки.

Пропускная способность и стоимость

Большинство биореакторных систем, в частности микрожидкостных чипов, имеют более низкую пропускную способность, чем стандартные 384-луночные или 1536-луночные пластины, ограничивая их использование на ранней стадии скрининга, где должны быть протестированы тысячи соединений. Стоимость расходных материалов, оборудования и обучения также выше, чем традиционная 2D-культура, которая может быть барьером для небольших компаний и академических лабораторий. Достижения в биореакторах на основе микролуночных и параллельных жидких системах начинают устранять этот разрыв.

Совместимость изображений и анализов

Стандартные высококонтентные изображения и биохимические анализы часто оптимизированы для плоских, прозрачных 2D-культур. Трубчатые каркасы, толстые 3D-ткани и жидкие корпуса могут мешать визуализации, требуя разработки специализированных методов микроскопии (например, конфокальных, мультифотонных, световых листов) и адаптированных анализов конечных точек. Неинвазивные датчики в реальном времени для биомаркеров, таких как альбумин, активность CYP и кислород, интегрируются в платформы биореакторов для преодоления этого узкого места, но они добавляют сложность и стоимость.

Интеграция иммунных клеток

В то время как многие платформы поддерживают кокультуру с клетками Купфера, включение циркулирующих иммунных клеток (например, нейтрофилов, Т-клеток) представляет дополнительные проблемы. Флюидный дизайн должен позволять вербовку иммунных клеток, экстравазацию и миграцию в ткань, имитируя процессы, которые происходят во время воспаления и иммуноопосредованного DILI. Это требует сложных многоквартирных конструкций и тщательного контроля хемотактических градиентов.

Регуляторная траектория и принятие отрасли

Регуляторный ландшафт для ПМП печени резко изменился в последние годы. Важным этапом стало принятие в 2022 году Закона о модернизации FDA 2.0, который устранил обязательное требование к тестированию на животных до клинических испытаний на людях по определенным показаниям. Это законодательство явно позволяет использовать альтернативные методы, включая клеточные анализы и технологии «орган на чипе», для поддержки применения новых лекарственных средств для исследований (IND).

FDA активно оценивало несколько платформ для печени на чипе через свою программу MPS. Центр оценки и исследований лекарств агентства (CDER) опубликовал отчеты, указывающие, что эти платформы могут предоставить надежные данные о DILI и метаболизме лекарств. В то время как полная нормативная квалификация все еще продолжается, FDA приняло данные от MPS печени для поддержки клинических испытаний на индивидуальной основе. Эта регуляторная гибкость является сильным драйвером для принятия в отрасли. Читайте о Законе о модернизации FDA 2.0 и альтернативных методах здесь .

Фармацевтические компании все чаще интегрируют ППС печени в свои трубопроводы разработки лекарств. Крупные игроки, такие как Janssen, Pfizer, Roche и AstraZeneca, опубликовали исследования валидации с использованием систем перфузии печени на чипе и 3D. Эти компании обычно развертывают МПС многоуровневым способом: используя высокопроизводительные 3D-сфероидные культуры для первоначального скрининга токсичности, а затем развертывая микрофлюидные или перфузионные биореакторы для более детальных механистических исследований потенциальных свинцов и резервных кандидатов.

Будущие направления: интеграция, автоматизация и клинический перевод

Следующий рубеж для технологии биореакторов печени лежит в интеграции и автоматизации. Объединение моделей микрожидкой печени с автоматизированной обработкой жидкости и зондированием в реальном времени позволит обеспечить истинную физиологию с высокой пропускной способностью, где тысячи соединений могут быть проверены в контексте, соответствующем человеку. Искусственный интеллект и машинное обучение (ИИ / МЛ) будут играть все более важную роль в интерпретации сложных многопараметрических данных, генерируемых этими системами, выявляя закономерности токсичности, которые коррелируют с клиническими результатами человека.

Еще одна важная тенденция - развитие иммунокомпетентных и мультиорганных моделей. Подключение чипов печени к моделям кишечника, почек, сердца или опухоли позволяет изучать метаболизм, распределение и токсичность между органами в рамках одной платформы. Эти системы "человек на чипе" обещают обеспечить еще более всеобъемлющие прогнозы поведения лекарств у людей.

В более долгосрочной перспективе технологии биореакторов масштабируются и совершенствуются для клинического перевода. Биоискусственные устройства печени (БАЛ) с использованием биореакторов из полых волокон, засеянных гепатоцитами человека, разрабатываются в качестве систем временной поддержки пациентов с острой печеночной недостаточностью, связывая их с восстановлением или трансплантацией. В то время как клинические испытания БАЛов показали смешанные результаты, недавние достижения в области клеточного поиска (например, гепатоциты, полученные из ИПСК) и конструкция биореактора возобновляют интерес к этому применению.

Заключение

Новые технологии биореакторов коренным образом изменили ландшафт моделирования тканей печени для тестирования лекарств. Благодаря интеграции принципов инженерии, клеточной биологии и материаловедения эти системы вышли за рамки 2D-культуры и моделей на животных, чтобы обеспечить платформы, соответствующие человеческому фактору, для изучения токсичности лекарств, метаболизма и болезней. Микрофлюидные чипы, 3D-перфузионные биореакторы, биопечатные конструкции и системы подвески предлагают уникальные преимущества, и их постоянное совершенствование неуклонно увеличивает их внедрение в фармацевтической промышленности.

В то время как проблемы, связанные со стандартизацией, пропускной способностью и стоимостью, остаются, регуляторные попутные ветра, предусмотренные Законом о модернизации FDA 2.0 и активной позицией регулирующих органов, ускоряют переход от академического развития к промышленному развертыванию. Поскольку эти технологии становятся более автоматизированными, интегрированными и проверенными, они будут играть все более центральную роль в снижении риска открытия лекарств, снижении зависимости от тестирования на животных и, в конечном итоге, предоставлении более безопасных, более эффективных методов лечения пациентам. Будущее прогностической токсикологии заключается не в том, можем ли мы моделировать печень, а в том, насколько точно и эффективно мы можем воссоздать ее функцию в контролируемой, масштабируемой среде биореактора.