Применение микрожидкостных чипов для высокопроизводительного скрининга условий регенерации хряща

Повреждение хряща от травмы или остеоартрита затрагивает миллионы людей во всем мире, но эффективная регенерация остается серьезной клинической проблемой. Взрослый хрящ не обладает внутренней целительной способностью, и современные методы лечения, такие как микрофрагментация или аутологичная имплантация хондроцитов, часто производят фиброкартиле с более низкими механическими свойствами. Технологии высокопроизводительного скрининга имеют потенциал для ускорения открытия оптимальных условий для восстановления хряща, а микрофлюидные чипы появились в качестве особенно мощной платформы. Точно контролируя динамику жидкости, биохимические градиенты и механические стимулы в микромасштабе, эти устройства позволяют исследователям одновременно исследовать сотни условий с использованием минимальных реагентов и клеток. В этой статье рассматривается применение микрофлюидных чипов для высокопроизводительного скрининга условий регенерации хряща, исследуя их дизайн, преимущества, ключевые приложения и будущие направления.

Понимание микрофлюидных чипов: дизайн и изготовление

Микрофлюидные чипы, также известные как устройства «лаборатория на чипе», состоят из сетей каналов с размерами от десятков до сотен микрометров. Эти каналы обычно изготавливаются из полидиметилсилоксана (PDMS), стекла или термопластов с использованием мягкой литографии, горячего тиснения или литья под давлением. Небольшой масштаб позволяет осуществлять ламинарный поток, быстрый тепло- и массовый перенос и создание стабильных градиентов концентрации - функций, которые невозможно достичь в обычных колодцев или чашках Петри.

Типичный микрофлюидный чип хряща содержит несколько параллельных каналов или камер, где клетки - хрящевые клетки, мезенхимальные стволовые клетки (МКС) или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - засеяны в гидрогеле или каркасе. Системы перфузии доставляют питательные вещества и факторы роста при удалении отходов, имитируя интерстициальный поток, который происходит в нативном хряще. Некоторые конструкции включают пневматические клапаны и насосы для автоматизации обмена средами, что позволяет проводить долгосрочные эксперименты по культивированию и последовательному дозированию. Чипы могут быть интегрированы с датчиками для мониторинга pH, кислорода и метаболита, обеспечивая обратную связь в реальном времени о поведении клеток.

Материалы и биосовместимость

PDMS остается наиболее распространенным материалом из-за его оптической прозрачности, газопроницаемости и простоты прототипирования. Однако PDMS может поглощать небольшие гидрофобные молекулы и может выщелачивать несшитые олигомеры, что может сбивать с толку результаты скрининга лекарств. Исследователи рассмотрели это, нанеся поверхностные покрытия, такие как парилен или используя альтернативные материалы, такие как циклический олефиновый сополимер (COC) или поли(метилметакрилат) (PMMA). Для хрящевых применений материал чипа также должен поддерживать адгезию клеток и осаждение матрицы. Покрытие каналов фибронектином, коллагеном II типа или гиалуроновой кислотой усиливает присоединение хондроцитов и поддержание фенотипа.

Ключевые преимущества микрофлюидных чипов для исследований хряща

Перевод микрофлюидной технологии на регенерацию хряща предлагает несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами культуры:

Высокопроизводительный параллельный скрининг

Обычные эксперименты проверяют одно состояние на скважину в 96-луночной пластине, требующей большого количества клеток и реагентов. Микрожидкостные чипы могут интегрировать десятки или даже сотни камер на одном устройстве, каждая из которых подвергается воздействию уникальной комбинации факторов. Например, чип генератора градиента может создавать непрерывный спектр концентраций фактора роста, позволяя исследователям идентифицировать оптимальную дозу для хондрогенеза в одном эксперименте. Эта высокая пропускная способность резко ускоряет скрининг лекарств, биоматериалов и параметров культуры.

Минимальное потребление реагентов

Микрофлюидные каналы содержат субмикролитровые объемы, уменьшая количество необходимых дорогостоящих факторов роста, цитокинов или фармацевтических соединений. Это особенно важно для исследований хряща, где такие факторы, как костные морфогенетические белки (BMP) и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) являются дорогостоящими. Более низкое использование реагентов также снижает общую стоимость на экспериментальное состояние, что позволяет проводить более крупные исследования в рамках типичных бюджетов.

Точный пространственно-временной контроль

Микромасштабная среда позволяет осуществлять изысканный контроль над химическими и физическими сигналами. Исследователи могут устанавливать градиенты кислорода для моделирования гипоксических условий суставного хряща, применять динамическое сжатие или сдвиговое напряжение через интегрированные приводы и доставлять факторы роста в пульсативные или непрерывные узоры. Такой контроль невозможен в статических колодцах и имеет решающее значение для повторного использования сложной микросреды нативного хряща.

3D Культура и Тканевая Организация

Клетки хряща ведут себя более физиологически, когда культивируются в трех измерениях, а не в виде монослоев. Микрофлюидные чипы легко поддерживают 3D культуру путем включения гидрогелей (например, агарозы, альгинат, коллаген) или децеллюляризованного внеклеточного матрикса (ECM) в каналы. Клетки, встроенные в эти матрицы, образуют узловые агрегаты и отлагают специфические для хряща компоненты ECM, такие как аггреканы и коллаген типа II. Некоторые продвинутые чипы включают микростолбы или пористые мембраны, чтобы имитировать зональную архитектуру суставного хряща, с поверхностной зоной, средней зоной и глубокой зоной.

Мониторинг и интеграция в реальном времени

Оптическая прозрачность позволяет проводить временную микроскопию для отслеживания морфологии, пролиферации и миграции клеток. В сочетании с флуоресцентными датчиками или молекулярными маяками чипы могут сообщать о экспрессии генов или секреции белка в режиме реального времени. Интегрированные электроды могут измерять электрическое импеданс или внеклеточный рН, обеспечивая неразрушающие показания здоровья клеток. Этот непрерывный поток данных позволяет динамически корректировать экспериментальные условия, концепция, известная как «контролируемая обратная связь микрофлюидика».

Применение в исследованиях регенерации хряща

Микрофлюидные чипы были развернуты в широком спектре исследований хряща, от фундаментальной биологии до доклинических испытаний лекарств. Следующие подразделы выделяют наиболее эффективные области.

Скрининг факторов роста и цитокинов

Дифференциация МСК на хондроциты и поддержание фенотипа хондроцитов зависит от тонкого баланса сигнальных молекул. Микрофлюидные градиентные генераторы могут подвергать клетки воздействию десятков комбинаций TGF-β3, BMP-2, BMP-7, инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) и модуляторов Wnt в одном чипе. Одно исследование показало, что МСК, культивируемые в микрофлюидном устройстве с непрерывным градиентом TGF-β3, производили дозозависимое увеличение содержания сульфированного гликозаминогликана (sGAG), определяя 10 нг/мл как оптимальную концентрацию. Такой быстрый скрининг потребовал бы сотен отдельных традиционных культур.

Тестирование механических стимулов

Механическая нагрузка необходима для гомеостаза хряща. Микрофлюидные чипы, оснащенные диафрагменными клапанами или магнитными бусинами, могут применять циклическое сжатие, сдвиг или гидростатическое давление к встраиваемым клеткам. Исследователи использовали эти устройства, чтобы показать, что динамическое сжатие при 1 Гц и 10% напряжении активирует экспрессию аггрекана и коллагена типа II при подавлении экспрессии коллагена типа I (маркер фиброкартиля). Другое исследование объединило напряжение сдвига жидкости с градиентами TGF-β для имитации совместной среды во время упражнений, обнаружив, что два стимула синергетически усиливают производство ECM. Эти идеи направляют разработку протоколов реабилитации и биореакторов тканевой инженерии.

Скрининг лекарств и соединений

Микрофлюидные чипы позволяют проводить высокопроизводительный скрининг библиотек малых молекул на хондропротекторную или хондроиндуктивную активность. Малые объемы снижают потребление соединений, позволяя проводить скрининг редких или дорогих кандидатов. Например, чип, предназначенный для тестирования 64 противовоспалительных соединений на интерлейкин-1β-стимулированных хондроцитах, выявил три перспективных кандидата, которые снижали активность матрикс-металлопротеиназы (ММП) без цитотоксичности. Аналогично, природные продукты, такие как куркумин, ресвератрол и глюкозамин, были оценены в микрофлюидных платформах, выявляя дозозависимые эффекты на жизнеспособность клеток и синтез ECM, которые соответствовали или превышали результаты на животных моделях.

Оценка биоматериалов и лесов

Выбор правильного каркаса имеет решающее значение для инженерии хрящевой ткани. Микрофлюидные чипы могут содержать капли гидрогеля или микросферы, содержащие различные полимерные составы (например, желатиновый метакрилоил, гиалуроновую кислоту, полиэтиленгликоль) и различную плотность сшивания. Путем пропитывания культуральной среды через чип ученые могут оценивать жизнеспособность клеток, осаждение матрицы и механическую целостность в течение нескольких недель. Один заметный чип содержал 48 отдельных микроячеек, заполненных фотосшиваемыми гидрогелями, каждый с различной жесткостью или скоростью деградации. Экран показал, что модуль хранения 10-20 кПа и период полураспада деградации 21 день оптимально поддерживает хондрогенез.

Модели совместной культуры и паракринные сигналы

Регенерация хряща часто выигрывает от совместной культуры с синовиальными клетками, остеобластами или иммунными клетками. Микрофлюидные чипы могут разделять различные типы клеток в отдельных камерах, связанных микроканалами, позволяя передавать паракрины при предотвращении прямого контакта с клетками. Эта конструкция выяснила, как синовиальные фибробласты способствуют редифференцировке хондроцитов через цитокины, такие как онкостатин M, и как макрофаги M1 ингибируют матричный синтез. Такие модели бесценны для изучения деградации хряща, вызванной воспалением, и для тестирования иммуномодулирующих методов лечения.

Персонализированная медицина и специфический скрининг пациентов

С появлением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и хондроцитов, полученных от пациентов, микрофлюидные чипы предлагают платформу для персонализированного скрининга. Собственные клетки пациента могут культивироваться в чипе и подвергаться воздействию группы лекарств или условий роста для определения наиболее эффективной регенеративной стратегии. Исследования Proof-of-concept использовали чипы для тестирования ответов на кортикостероиды, ингибиторы TNF и анаболические агенты на клетках пациентов с остеоартритом, выявляя межиндивидуальную изменчивость, которая могла бы направлять прецизионную медицину.

Интегративные технологии, расширяющие исследования микрофлюидных хрящевых

Мощность микрофлюидных чипов усиливается в сочетании с другими передовыми методами.

3D биопечать

Биопечать может производить сложные, специфические для пациента конструкции хряща, которые затем интегрируются в микрофлюидные чипы для динамической культуры. Например, биопечатный каркас, содержащий распределение зональных клеток, может быть помещен внутрь перфузионного чипа, который доставляет питательные вещества через каналы, имитирующие интерфейс субхондральной кости. Этот гибридный подход позволяет длительно культивировать большие конструкции и обеспечивает платформу для тестирования стратегий хирургической имплантации.

Искусственный интеллект и машинное обучение

Высокопроизводительные микрофлюидные эксперименты генерируют огромные наборы данных - изображения, профили экспрессии генов, механические измерения. Алгоритмы машинного обучения могут майнить эти данные для выявления закономерностей и прогнозирования оптимальных условий. Свёрточные нейронные сети (CNN) были обучены автоматически оценивать морфологию хондроцитов и покрытие ECM из микрофлюидных изображений с замедлением времени. Модели обучения с подкреплением могут даже контролировать параметры перфузии чипа в режиме реального времени, чтобы максимизировать производство матрицы, создавая систему оптимизации замкнутого цикла.

Визуализация в реальном времени и биосенсоры

Достижения в интеграции биосенсоров позволяют непрерывно считывать ключевые биомаркеры. Микрофлюидные чипы со встроенными электрохимическими датчиками могут обнаруживать показатели потребления лактата, глюкозы и кислорода, обеспечивая метаболическое профилирование хондроцитов. Поверхностно-усиленные датчики рамановского рассеяния (SERS) могут контролировать расщепление аггреканов MMP в режиме реального времени. В сочетании с конфокальной микроскопией эти инструменты дают исследователям динамическое, многомерное представление о регенерации хряща.

Тематические исследования и репрезентативные выводы

Для иллюстрации воздействия микрофлюидных чипов выделены два репрезентативных исследования.

Пример 1: Определение оптимального соотношения TGF-β3 и BMP-2 для МСК-хондрогенеза

Исследователи из ведущей биомедицинской инженерной лаборатории разработали микрофлюидный градиентный генератор, который подвергал человеческие МСК 64 различным комбинациям TGF-β3 (0-50 нг/мл) и BMP-2 (0-100 нг/мл) в 3D-агарозном геле. После 21 дня перфузионной культуры они анализировали содержание sGAG, осаждение коллагена II типа и экспрессию генов SOX9, ACAN и COL2A1. Было обнаружено оптимальное соотношение 10 нг/мл TGF-β3 плюс 25 нг/мл BMP-2, что производило на 40% больше sGAG, чем лучшее однофакторное состояние. Этот результат был подтвержден в культурах гранул и модели на маленьком животном. Микрофлюидный экран использовал только одну десятую реагентов и клеток обычного скрининга и был завершен за один месяц вместо шести.

Пример 2: Высокопроизводительный противовоспаляющий лекарственный экран на остеоартритных хондроцитах

В отдельном исследовании первичные хондроциты от пациентов с терминальной стадией остеоартрита были засеяны в микрофлюидный чип с 96 камерами. Каждая камера получала различную концентрацию одного из восьми противовоспалительных соединений (целецоксиб, диклофенак, преднизолон и т.д.) в сочетании с IL-1β. Через 48 часов на чипе проводилось окрашивание живым/мертвым и MMP-13 ELISA. Экран выявил, что низкодозированный диклофенак (0,1 мкМ) в сочетании с новым ингибитором NF-κB снижал MMP-13 на 80% без цитотоксичности. Эта комбинация не была предсказана предшествующей литературой и подчеркивает способность чипа к случайному открытию.

Проблемы и ограничения

Несмотря на свои обещания, микрофлюидные чипы сталкиваются с несколькими препятствиями, прежде чем они будут широко распространены в исследованиях хряща.

Будущие перспективы

В следующем десятилетии микрофлюидные чипы станут стандартным инструментом в исследованиях хряща и разработке лекарств.

Интеграция с системами орган-на-чипе: Мультиорганные чипы, которые соединяют хрящ, кость и синовий, будут моделировать весь сустав. Эти системы могут воспроизводить прогрессирование остеоартрита и тестировать системные методы лечения в соответствующей человеку среде без жертвоприношения животных.

Автоматизация и коммерциализация: Такие компании, как Emulate, Mimetas и TissUse, уже предлагают коммерческие платформы для работы с органами на чипах. Чипы, специфичные для хряща, с предопределенными градиентными генераторами и механическими приводами, могут стать коммерчески доступными, снижая барьер для входа.

Клинический перевод: Микрофлюидные чипы могут быть использованы для контроля качества аутологичных хондроцитных имплантатов или для скрининга клеток пациентов на лучшую комбинацию факторов роста перед операцией. Этот персонализированный подход улучшит результаты и снизит показатели пересмотра.

Регуляторное принятие: Поскольку чипы предоставляют более физиологически релевантные данные, чем тарелки скважин, регулирующие органы, такие как FDA, изучают их использование в методологиях нового подхода (NAMs) для сокращения тестирования на животных.

Внешние ресурсы и дальнейшее чтение

Для читателей, интересующихся более глубокими техническими деталями, следующие ссылки предоставляют отличные обзоры и оригинальные исследования.

  1. Bhatia, S. N., & Ingber, D. E. (2014). Микрофлюидные органы на чипах. Природная биотехнология , 32(8), 760–772. https://doi.org/10.1038/nbt.2989
  2. Visser, J., et al. (2015). Microfluidic screening of hydrogel properties for cartilage tissue engineering. Биоматериалы, 74, 2-12. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.09.036
  3. Luo, Z., et al. (2019). Микрофлюидный чип для высокопроизводительного скрининга комбинаторных комбинаций лекарственных средств для лечения остеоартрита. Лаборатория на чипе , 19(7), 1219-1228. https://doi.org/10.1039/C8LC01392F
  4. Mora-Boza, A., & García, A. J. (2020). Микрофлюидные платформы для инженерии хрящевой ткани. Передовые медицинские материалы , 9(22), 2001018. https://doi.org/10.1002/adhm.202001018
  5. Park, S. E., et al. (2021). Organ-on-a-chip for osteoarthritis: modeling joint inflammation and drug screening. Advanced Functional Materials, 31(45), 2104457. https://doi.org/10.1002/adfm.202104457

В заключение, микрожидкостные чипы предлагают преобразующий подход к высокопроизводительному скринингу условий регенерации хряща. Их способность точно контролировать клеточную микросреду, минимизировать потребление реагентов и интегрировать мониторинг в режиме реального времени устраняет многие ограничения традиционных методов. Ускоряя идентификацию оптимальных комбинаций факторов роста, механических стимулов, лекарств и биоматериалов, эти устройства готовы ускорить разработку эффективных методов лечения для восстановления хряща и остеоартрита. По мере совершенствования технологий изготовления и интеграции с ИИ и достижениями биопечати микрожидкие чипы станут незаменимым инструментом как в фундаментальных исследованиях, так и в клиническом переводе.