Применение технологии Crispr для модификации клеток в культуре в исследовательских целях

Введение в CRISPR-Based Cell Engineering

Появление технологии кластеризованных регулярно пересекающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) коренным образом изменило то, как исследователи манипулируют геномом культивируемых клеток. Благодаря возможности точных, программируемых правок практически в любом месте эукариотического генома системы CRISPR позволяют ученым создавать изогенные клеточные линии, выполнять функциональные геномные экраны и создавать точные модели заболеваний в блюде. В отличие от более ранних инструментов редактирования генов, таких как нуклеазы цинковых пальцев или TALEN, CRISPR проще в проектировании, быстрее в реализации и более масштабируема, что делает его доминирующей платформой для исследований клеточной культуры сегодня.

В этой статье представлен всеобъемлющий технический обзор применения CRISPR для модификации культивируемых клеток. Мы охватываем основные компоненты CRISPR-Cas9, подробные протоколы доставки и отбора, передовые стратегии редактирования, общие подводные камни и новые инновации, которые продвигают область вперед. Цель состоит в том, чтобы дать как новым, так и опытным исследователям практическое, готовое к производству руководство по использованию CRISPR в рабочих процессах клеточной культуры.

Основные компоненты CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 состоит из двух основных молекул: эндонуклеазы Cas9 и одной направляющей РНК (sgRNA). В sgRNA содержится 20-нуклеотидная пропеллерная последовательность, которая комплементарна к области ДНК-мишени, за которой следует каркас, связывающий Cas9. Для Cas9, чтобы разрезать, за целевой ДНК должен немедленно следовать короткий протопространствор, смежный мотив (PAM), обычно NGG для Streptococcus pyogenes Cas9. Когда sgRNA и Cas9 образуют комплекс рибонуклеопротеинов (RNP), они сканируют геном для последовательностей PAM; как только найдено совпадение, Cas9 индуцирует разрыв двухцепочечной цепи (DSB) около трех пар оснований выше по потоку PAM.

Исследователи могут проектировать sgRNAs с использованием таких инструментов, как CHOPCHOP, чтобы максимизировать целевую активность и минимизировать внецелевой потенциал. DSB затем восстанавливается одним из двух эндогенных путей: негомологичным конечным присоединением (NHEJ), которое подвержено ошибкам и вводит небольшие вставки или делеции (индели), которые могут нарушить функцию генов; или гомологически направленным ремонтом (HDR), который использует экзогенный шаблон донора для вставки точных правок или кассет репортеров. Понимание этих путей имеет решающее значение для выбора правильной стратегии редактирования.

NHEJ: Нокауты и мутации инделов

Для большинства исследований потери функции NHEJ является предпочтительным путем. Доставляя Cas9 и sgRNA, нацеленные на кодирующий экзон, исследователи генерируют смесь инделов, вызывающих сдвиги кадров или преждевременные стоп-кодоны. После периода восстановления клетки клонируются и секвенируются для проверки нокаута. Этот подход широко используется для создания нулевых аллелей в клеточных линиях для изучения генной существенности, сигнальных путей и чувствительности к лекарственным средствам.

HDR: нокины и точные изменения

Когда требуется точная модификация — например, вставка флуоресцентной метки, точечной мутации или условной аллели — используется HDR. Эффективность HDR в увековеченных клеточных линиях обычно низкая (1-10%) и требует совместной доставки донорского шаблона. Донором может быть одноцепочечный олигонуклеотид (ssODN) для небольших правок или гомологическая конструкция руки на основе плазмиды для более крупных вставок. Для обогащения для HDR-отредактированных клеток исследователи часто включают маркер селекции (например, резистентность к пуромицину) или используют сортировку клеток, активированных флуоресценцией (FACS).

Доставка компонентов CRISPR в культивируемые клетки

Успех эксперимента CRISPR в значительной степени зависит от эффективной доставки белка Cas9 и sgRNA в ядро. Доступно несколько методов, каждый из которых имеет преимущества и ограничения. Выбор зависит от типа клетки, бюджета и желаемой пропускной способности.

Липофекция

Липофекция использует катионные липидные реагенты для образования комплексов с плазмидной ДНК, кодирующей Cas9 и sgRNA. Она проста и хорошо работает для легко трансфицируемых линий, таких как HEK293T, HeLa и многие линии раковых клеток. Однако липофекция менее эффективна для первичных клеток, стволовых клеток и суспензионных клеток. Наличие плазмидной ДНК также может вызывать врожденные иммунные реакции в некоторых типах клеток.

Электропорация

Электропорация применяет короткий электрический импульс для временной пермеабилизации клеточной мембраны, позволяя проникать в комплексы ДНК, РНК или RNP. Современные системы, такие как нуклеофектор Лонзы или Thermo Fisher Neon, обеспечивают высокую эффективность даже в трудно трансфицируемых клетках, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и Т-клетки. Электропорация комплексов RNP — предварительно сформированного белка Cas9, связанного с sgRNA — особенно популярна, поскольку она устраняет риск интеграции плазмид и достигает быстрого редактирования (обнаруживаемого в течение 24-48 часов).

Вирусные векторы

Для клеток, которые не поддаются трансфекции, вирусная трансдукция обеспечивает надежную альтернативу. Лентивирусные векторы могут стабильно интегрировать кассеты экспрессии Cas9 и sgRNA, что делает их идеальными для объединенных экранов CRISPR. Векторы аденоассоциированного вируса (AAV) также используются для доставки шаблонов доноров в экспериментах HDR, хотя их емкость упаковки ограничена (~ 4,5 кб). Исследователи должны помнить о соображениях биобезопасности и потенциале случайной интеграции при использовании лентивируса.

Методы микроинъекции и наночастицы

Микроинъекция трудоемкая, но может достигать одноклеточной точности, часто используется для редактирования зиготы в трансгенном животноводстве.Совсем недавно были разработаны липидные наночастицы и наночастицы золота для временной доставки Cas9 мРНК и sgRNA, предлагая невирусную альтернативу с более низкой иммуногенностью.

Выбор, обогащение и валидация отредактированных клеток

После доставки только подмножество клеток будет иметь желаемое редактирование. Стратегии обогащения необходимы для получения чистой популяции для экспериментов вниз по течению.

Флуоресцентные репортеры и FACS

Включение флуоресцентного репортера (например, GFP или BFP) в монтажную кассету или использование совместной доставки отдельного флуоресцентного маркера позволяет FACS-сортировке изолировать успешно модифицированные клетки. Для HDR-детонов клетки можно сортировать на основе экспрессии флуоресцентного тега, значительно ускоряя клональную изоляцию.

Селекционные антибиотики

Если вводится ген устойчивости к пуромицину, бластицидину или неомицину, отбор антибиотиков может быстро обогащаться для отредактированных клеток.Однако этот метод не различает клетки, которые интегрировали ген устойчивости в целевой локус, по сравнению со случайными событиями интеграции, поэтому необходима дополнительная проверка.

Генотипирование и валидация

Кандидатские клоны должны быть генотипированы с использованием ПЦР, секвенирования Сэнгера или секвенирования следующего поколения. Для нокаутных клонов рекомендуется сочетание секвенирования по всему участку выреза и западного блота для потери белка. Для нокаутов ПЦР дальнего действия, охватывающая оба рукава гомологии, может подтвердить правильную интеграцию, а секвенирование развязок может исключить индели на ремонтных развязках.

Применение CRISPR-модифицированных клеток в исследованиях

Диапазон экспериментальных вопросов, которые можно решить с помощью клеток, отредактированных CRISPR, огромен. Ниже мы выделяем несколько ключевых областей.

Функциональные геномные экраны

Объединённые CRISPR-экраны используют лентивирусные библиотеки, содержащие тысячи sgРНК, для систематического выбивания каждого гена в геноме. После отбора на фенотип (например, выживаемость клеток при медикаментозном лечении или устойчивость к вирусной инфекции), глубокое секвенирование интегрированных sgРНК идентифицирует гены, которые необходимы для процесса. Этот подход сыграл важную роль в обнаружении новых уязвимостей рака, факторов-хозяев для патогенов и регуляторов иммунных реакций.

Моделирование заболеваний с помощью изогенных клеточных линий

Вводя специфические мутации пациента в линию контрольных клеток, исследователи создают изогенные модели, которые отличаются только интересующей мутацией. Это устраняет путаные генетические фоновые эффекты. Например, введение мутации 185delAG в эпителиальные клетки MCF10A груди позволяет точно изучить, как это единственное изменение влияет на репарацию ДНК и опухолевый генезис. Аналогично, iPSCs от пациентов можно исправить в дикий тип с использованием HDR, обеспечивая мощную платформу для изучения спасения болезни.

Вмешательство и активация CRISPR (CRISPRi/a)

Каталитически мертвый Cas9 (dCas9), слитый с транскрипционными репрессорами (например, KRAB) или активаторами (например, VP64), обеспечивает модуляцию экспрессии генов без разрезания ДНК. CRISPRi может заглушить гены с высокой специфичностью, в то время как CRISPRa может активировать эндогенные гены. Эти инструменты особенно полезны для изучения основных генов, которые нельзя выбить, или для экранов усиления функции.

Линейный поиск и штрихкодирование

Доставляя библиотеку уникальных последовательностей штрих-кода через HDR в безопасный локус гавани, исследователи могут отслеживать клональную динамику популяций клеток с течением времени. Этот метод, известный как штрих-код CRISPR или CARLIN, показывает, как отдельные клетки способствуют дифференцировке, метастазированию или лекарственной устойчивости.

Проблемы и технические подводные камни

Несмотря на свою силу, редактирование CRISPR в клеточной культуре не лишено трудностей. Признание и смягчение этих проблем имеет решающее значение для воспроизводимых результатов.

Нецелевые эффекты

Cas9 может переносить несоответствия в дуплексе sgRNA:DNA, что приводит к непреднамеренным изменениям в других местах генома. Мутации вне цели могут спутать фенотипический анализ и ввести в заблуждение эксперименты по нисходящему потоку. Стратегии минимизации нецелевых эффектов включают использование вариантов Cas9 высокой точности (например, eSpCas9, SpCas9-HF1), выбор sgRNA с высокими показателями специфичности и экспериментальную проверку лучших прогнозируемых участков вне цели посредством целенаправленного секвенирования.

Низкая эффективность HDR

HDR часто неэффективен, особенно в неразделяющихся или медленно делящихся клетках, поскольку для его усиления требуются донорский шаблон и активные гомологичные механизмы рекомбинации. Для усиления HDR исследователи могут синхронизировать клетки в S-фазе с использованием химических ингибиторов (например, нокодазола), использовать небольшие молекулы, которые подавляют NHEJ (например, ингибиторы SCR7 или ДНК-PKcs), или доставлять очищенные комплексы белка Cas9-RNP с модифицированными донорскими шаблонами, которые имеют фосфоротиоатные связи.

Мозаицизм и клональная изменчивость

Даже после одноклеточного клонирования не все клетки в популяции могут иметь одинаковую правку из-за длительной экспрессии Cas9 или продолжающегося восстановления. Особенно проблематично это в стволовых клетках. Ограничение экспрессии Cas9 коротким импульсом (с использованием доставки RNP или индуцируемых систем) снижает мозаичность. Кроме того, рекомендуется тщательная проверка нескольких независимых клонов для обеспечения фенотипической консистенции.

Токсичность клеток и стресс доставки

Трансфекция, электропорация и вирусная трансдукция могут вызывать клеточные стрессовые реакции, включая передачу сигналов о повреждении ДНК и апоптоз. Используя оптимизированные протоколы, минимизируя количество доставленной нуклеиновой кислоты и позволяя адекватное время восстановления может улучшить здоровье клеток. Для чувствительных типов клеток, таких как первичные нейроны или гемопоэтические стволовые клетки, часто предпочтительнее доставка на основе RNP с мягкими условиями электропорации.

Этические и нормативные соображения

Хотя редактирование клеток в культуре для фундаментальных исследований подпадает под стандартные институциональные рекомендации по биобезопасности и рекомбинантной ДНК, несколько этических аспектов требуют внимания. Когда используются иПСК человека или эмбриональные стволовые клетки, может потребоваться дополнительный надзор со стороны комитетов по надзору за исследованиями стволовых клеток. Редактирование соматических клеток для потенциальных терапевтических применений должно придерживаться строгих правил FDA и EMA. Редактирование зародышевой линии - модификация спермы, яйцеклеток или эмбрионов - вызывает глубокие этические проблемы и в настоящее время не разрешено в большинстве стран для клинического использования. Исследователи должны оставаться в курсе общественного дискурса и обеспечивать соответствие своей работы ответственной практике исследований.

Будущие направления и новые технологии

Область CRISPR продолжает быстро развиваться. Ниже приведены ключевые разработки, которые обещают еще больше расширить сферу редактирования клеточной культуры.

Базовый монтаж

Базовые редакторы сливают каталитически нарушенный Cas9 (никазу) с ферментом деаминазы, что позволяет напрямую преобразовывать одну пару оснований в другую (например, C→T или A→G), не требуя DSB или донорского шаблона. Эта технология идеально подходит для моделирования точечных мутаций и коррекции патогенных SNP в клеточных линиях с высокой эффективностью и минимальными побочными продуктами индел.

Премьер-редактор

В прайм-редактировании используется никаза Cas9, слитая с обратной транскриптазой, вместе с прайм-редактирующей направляющей РНК (пегРНК), которая несет желаемое редактирование. Она может вводить вставки, делеции и все 12 возможных преобразований от основания к основанию с очень небольшим количеством внецелевых редакций. Хотя доставка в клеточной культуре является более сложной, прайм-редактирование быстро получает распространение для точной генетической модификации.

Редактирование и органоидные модели

Все большее число исследований применяют CRISPR непосредственно к клеткам внутри органоидов или путем введения компонентов редактирования в живых животных. Например, доставка компонентов CRISPR через AAV в сетчатку или печень мышиных моделей позволяет коррекцию генетических дефектов in situ. Комбинирование CRISPR с 3D системами культивирования органоидов обеспечивает еще более физиологически релевантную платформу для изучения развития и болезней.

Многослойное редактирование и синтетическая биология

Используя одновременно несколько sgRNAs, исследователи могут редактировать сразу несколько генов, позволяя строить синтетические генные схемы или моделировать полигенные заболевания. Такие системы, как нуклеаза MAD7 (Cas12a), которая обрабатывает собственный массив CRISPR, упрощают мультиплексирование. Кроме того, CRISPR можно использовать для интеграции больших синтетических генных кластеров в безопасные гавани локусов, открывая дверь для программирования поведения клеток для биопроизводства.

Практические соображения по протоколу

Для реализации редактирования CRISPR в клеточной культуре мы рекомендуем следующий рабочий процесс:

Проектирование 3-5 sgRNAs на цель с использованием проверенных алгоритмов прогнозирования (]Doench et al., Nature Biotechnology, 2016].
Клоны sgРНК в экспрессионный вектор (например, lentiCRISPRv2) или приобретают химически модифицированные синтетические sgРНК.
Доставить Cas9 и sgRNA наиболее подходящим методом для вашего типа клеток (электропорация RNP для стволовых клеток; липофекция плазмид для HEK293T).
Позволяйте 48-72 часа для редактирования, затем собирайте геномную ДНК и выполняйте тест T7E1 или Surveyor для оценки эффективности редактирования.
Энрих редактировал клетки с помощью коэкспрессированного маркера отбора или FACS, затем одноклеточные сортировали на 96-луночные пластины.
Скрининговые клоны методом ПЦР и секвенирования Сэнгера и выборка по меньшей мере двух независимых клонов для фенотипической проверки.
Подтвердите редактирование на целевом уровне и проверьте сайты поверх целевого уровня с помощью секвенирования следующего поколения.

Подробные протоколы доступны в ресурсном центре CRISPR Addgene, который предлагает плазмиды, протоколы и руководства по устранению неполадок. Для высокопроизводительных экранов платформа генетической возмущения Broad Institute предоставляет предварительно разработанные библиотеки sgRNA и инструменты анализа [FLT: 3].

Заключение

Технология CRISPR стала незаменимым инструментом для модификации клеток в культуре, позволяя исследователям анализировать функцию генов, моделировать заболевания человека с беспрецедентной точностью и разрабатывать новые терапевтические стратегии. Тщательно разрабатывая sgRNAs, выбирая соответствующие методы доставки и тщательно проверяя отредактированные клоны, ученые могут использовать весь потенциал CRISPR для продвижения открытия. По мере того, как новые инструменты, такие как базовое редактирование и простое редактирование, продолжают созревать, репертуар генетических модификаций, достижимых в культивируемых клетках, будет только расти, обещая еще более глубокое понимание биологии и медицины.