Разработка портативных устройств геномного секвенирования для полевых исследований

Способность читать генетический план живых организмов преобразила биологические исследования, но в течение десятилетий эта энергия была заперта внутри обширных лабораторных зданий с дорогими машинами размером с комнату. Исследователи, которым нужны геномные данные из отдаленных тропических лесов, океанских полов или зон вспышек, столкнулись с разочаровывающим узким местом: собирают образец, сохраняют его, отправляют в лабораторию и ждут результатов неделями. Разработка портативных устройств геномного секвенирования разрушила эту парадигму. Сегодня устройство, которое помещается в рюкзак, может декодировать ДНК в режиме реального времени, предоставляя ученым возможность отвечать на срочные вопросы, пока они все еще стоят в поле. Эта статья исследует технологию, стоящую за этими устройствами, их ключевые вехи, широкомасштабное влияние на полевые исследования, а также проблемы и будущие направления, которые будут формировать следующее поколение портативных секвенсоров.

Введение в портативное геномное секвенирование

Портативное геномное секвенирование относится к способности выполнять секвенирование ДНК или РНК за пределами традиционной лабораторной среды, часто с использованием компактных инструментов на батарейках. Концепция не совсем новая - существовали ранние полевые PCR-машины, но способность секвенировать целые геномы или транскриптомы in situ представляет собой квантовый скачок. Прорыв произошел с коммерциализацией секвенирования нанопор, технологии, которая считывает нити ДНК, когда они проходят через наноскопическую пору белка. В отличие от более старых методов секвенирования, которые требовали оптического обнаружения и громоздких лазеров, секвенирование нанопор измеряет изменения электрического тока, позволяя миниатюризировать до такой степени, что основной датчик помещается на чип размером с ногтей.

Портативные секвенсоры позволяют исследователям получать геномную информацию в реальном времени, ускоряя все от идентификации видов во время обследований биоразнообразия до отслеживания эволюции вируса во время эпидемии. Наиболее известное устройство, MinION от Oxford Nanopore Technologies, весит менее 100 граммов и подключается к ноутбуку через USB. Другие портативные платформы включают Flongle и карманный SmidgION, предназначенный для работы на смартфоне. Внедрение этих устройств снизило барьер для входа для геномных исследований, демократизируя доступ к технологии секвенирования для лабораторий в условиях с низкими ресурсами и для полевых ученых, которым ранее приходилось полагаться на централизованные средства.

Ключевые технологические основы

Нанопорное секвенирование

В основе большинства переносных секвенсоров лежит технология нанопор. В синтетическую мембрану встроена белковая нанопора, и применяется ионный ток. По мере прохождения одноцепочечной молекулы ДНК через пору каждый нуклеотид (или группа нуклеотидов) нарушает ток характерным образом. Измеряя эти нарушения в реальном времени, секвенсор определяет последовательность оснований. Такой подход дает ряд преимуществ для полевого использования: он может считывать очень длинные фрагменты ДНК (десятки килобаз), он секвенирует непосредственно без амплификации для многих применений, и он обеспечивает потоковые данные по мере того, как молекула транслоцируется. Компромисс исторически был ниже по точности на базу по сравнению с короткочитанным секвенированием от таких компаний, как Illumina, но недавние улучшения в химии и алгоритмах базального секвенирования подтолкнули точность выше 99% для высококачественных прогонов, что делает портативное секвенирование конкурентоспособным для многих исследовательских вопросов.

Подготовка библиотеки в полевых условиях

Одним из самых больших препятствий для полевого секвенирования является подготовка образцов. Традиционная подготовка библиотеки включает в себя несколько этапов: извлечение ДНК, фрагментация, восстановление конца, лигирование адаптера и очистка - многие из которых требуют центрифуг, термоциклеров и холодного хранения. Портативное секвенирование привело к инновациям в упрощенных, удобных для полевых условий протоколах. Например, Oxford Nanopore предлагает наборы быстрого секвенирования, которые уменьшают подготовку до нескольких минут с минимальным оборудованием. Исследователи могут выполнять извлечение с использованием портативных устройств, таких как Bento Lab или набор для извлечения ДНК Promega Wizard HMW, адаптированный для полевого использования. Некоторые команды даже выполнили прямое секвенирование РНК из образцов тканей с минимальной обработкой, устраняя обратную транскрипцию и шаги амплификации. Этот прогресс означает, что полевой исследователь может перейти от образца к последовательности менее чем за час, все в палатке или транспортном средстве.

Базекалинг и анализ в реальном времени

Электрические сигналы, производимые секвенсорами нанопор, должны быть преобразованы в базовые вызовы — процесс, называемый базовым календарём. Более ранние устройства полагались на облачное или настольное программное обеспечение, но современные портативные рабочие процессы включают локальное базовое календарное с использованием GPU, встроенных в ноутбук или даже на самом устройстве секвенирования (например, MinION Mk1C имеет интегрированный компьютер). Базовый календарный анализ в реальном времени позволяет исследователям контролировать качество данных и останавливать запуск после достижения достаточного покрытия, экономя драгоценную мощность батареи и пространство для хранения. Кроме того, адаптивная выборка — метод, в котором секвенсор обогащается для конкретных геномных областей, отклоняя нежелательные показания во время запуска — становится возможной в портативных установках, позволяя целенаправленное секвенирование без дополнительной лабораторной работы. Эта возможность имеет решающее значение для полевого наблюдения за патогенами или конкретными генетическими маркерами.

Вехи в развитии портативного геномного секвенирования

Путь от секвенирования только в лаборатории до устройств, развертываемых на местах, отмечен несколькими ключевыми вехами, которые иллюстрируют как технологический прогресс, так и творческое решение проблем исследователями.

Программа раннего доступа MinION (2014)

В 2014 году Oxford Nanopore запустила программу доступа MinION (MAP), предоставляющую ранние подразделения глобальному сообществу исследователей. Первоначальные результаты были неоднозначными - точность была низкой, пропускная способность была переменной, и устройство требовало тщательной настройки. Однако MAP вызвал взрыв разработки методов, поскольку пользователи обменивались протоколами и обходными путями. К 2015 году команды секвенировали первый бактериальный геном полностью на MinION, а к 2016 году устройство использовалось для наблюдения за вирусом Эбола в Западной Африке. Эти ранние развертывания доказали, что портативное секвенирование может функционировать в сложных средах с ограниченной инфраструктурой, закладывая основу для более широкого внедрения.

В режиме реального времени наблюдение за вирусом Эбола и Зика

В период вспышки Эболы в Западной Африке в 2014–2016 годах в сотрудничестве между Оксфордской нанопорой, Европейской мобильной лабораторией и Африканским центром передового опыта в области геномики инфекционных заболеваний использовались секвенсоры MinION для генерации вирусных геномов в режиме реального времени. Образцы были собраны в полевых условиях, транспортированы в мобильную лабораторию и секвенированы в течение 24 часов. Этот быстрый поворот позволил эпидемиологам отслеживать цепочки передачи и идентифицировать новые мутации. Аналогичным образом, эпидемия вируса Зика 2015–2016 годов привела к развертыванию переносных секвенсоров в Бразилии и Карибском бассейне. Способность секвенировать РНК-вирусы непосредственно из клинических образцов (с использованием подходов на основе усилителей) была игровым фактором для реагирования на вспышки, демонстрируя, что геномная эпидемиология может перейти от эталонных лабораторий к передовой линии.

Антарктика и глубоководное секвенирование

Прочность переносных секвенсоров была протестирована в некоторых из самых экстремальных сред Земли. В 2019 году команда во главе с Британской антарктической службой секвенировала ДНК рыб внутри исследовательской станции в Антарктиде, используя MinION для изучения адаптации к холодным температурам. Устройство работало при минусовых температурах с незначительными модификациями (поддержание ноутбука и секвенсора теплыми внутри пластиковой коробки). Примерно в то же время ученые на борту исследовательского судна R / V Falkor секвенировали ДНК из глубоководных организмов с использованием дистанционно управляемого транспортного средства (ROV) и MinION на палубе. Эти экспедиции доказали, что геномное секвенирование не ограничивается умеренными, стабильными средами - это можно сделать на дне океана или на Южном полюсе.

Пандемия SARS-CoV-2: катализатор массового усыновления

Пандемия COVID-19 ускорила разработку и развертывание портативного секвенирования в беспрецедентных масштабах. MinION, наряду с более дешевыми проточными клетками Flongle, стал инструментом выбора для вирусного наблюдения в реальном времени во многих странах. Сеть ARTIC разработала протокол для секвенирования плиточного усилителя генома SARS-CoV-2 с использованием технологии нанопор, которая была принята лабораториями по всему миру, в том числе многими в условиях с низкими ресурсами, в которых не хватало инфраструктуры Illumina. Портативное секвенирование позволило учреждениям здравоохранения отслеживать варианты беспокойства, отслеживать динамику передачи и информировать политику. Пандемия доказала, что портативные секвенсоры могут обрабатывать требования высокой пропускной способности при надлежащем масштабировании, и это стимулировало улучшение точности, пропускной способности и обмена данными на основе облака.

Влияние на экологические и природоохранные полевые исследования

Оценка биоразнообразия с помощью экологической ДНК (eDNA)

Одним из наиболее перспективных применений переносного секвенирования является анализ ДНК окружающей среды (eDNA) — генетического материала, пролитого организмами в воду, почву или воздух. Традиционно образцы eDNA собираются и отправляются в лабораторию для метабаркодирования (усиления и секвенирования маркерных генов, таких как COI или 12S). Портативные секвенсоры теперь позволяют исследователям выполнять метабаркодирование непосредственно в полевых условиях. Например, команда, контролирующая водное биоразнообразие в удаленном потоке, может фильтровать воду, извлекать ДНК, запускать ПЦР и секвенировать ампликоны на MinION в течение двух дней. Эта способность на месте устраняет задержки и риски деградации образцов, связанные с доставкой. В 2022 году исследование, опубликованное в Методы в экологии и эволюции , показало, что полевое метабаркодирование eDNA с помощью MinION может обнаруживать рыб и видов амфибий с сопоставимой чувствительностью к лабораторному секвенированию Illumina, открывая

Криминалисты дикой природы и обнаружение браконьерства

Портативное геномное секвенирование все чаще используется в криминалистике дикой природы для борьбы с браконьерством и незаконной торговлей дикими животными. Власти могут секвенировать конфискованные продукты животного происхождения (слоновая кость, рог носорога, чешуя) на месте для определения вида, географического происхождения и даже индивидуальной идентичности животного. Характер анализа в реальном времени позволяет правоохранительным органам принимать немедленные решения - например, перенаправлять патрули на основе генетической подписи захвата. В 2020 году штрих-код системы данных о жизни (BOLD) интегрировал рабочие процессы на основе MinION для быстрой идентификации видов в полевых условиях. Технология также развертывается на пограничных контрольно-пропускных пунктах и аэропортах для проверки контрабандных предметов, уменьшая необходимость в справочных лабораторных подтверждениях, которые могут занять недели.

Мониторинг здоровья коралловых рифов

Коралловые рифы находятся под угрозой изменения климата, подкисления океана и загрязнения. Исследователи используют переносные секвенсоры для мониторинга микробиома кораллов и присутствия патогенов, таких как Виды вибриона. В исследовании 2021 года ученые развернули мобильную лабораторию на лодке в Большом Барьерном рифе, выполняя полное метагеномное секвенирование образцов кораллов в течение нескольких часов после сбора. Они обнаружили сдвиги в бактериальных сообществах, связанных с событиями отбеливания, и определили потенциальные показатели раннего предупреждения. Этот тип мониторинга в режиме реального времени может позволить менеджерам вмешиваться (например, затеняя рифы или устраняя стрессоры) до того, как произойдет широко распространенная смертность. Портативное секвенирование позволяет отслеживать здоровье рифов по обширным и отдаленным морским ландшафтам.

Влияние на управление вспышками инфекционных заболеваний

На месте патогенная идентификация и геномная эпидемиология

Во время вспышек заболеваний скорость имеет решающее значение. Портативные секвенсоры позволяют клиницистам и эпидемиологам идентифицировать возбудителя возбудителя из образца пациента в течение нескольких часов. Например, в 2018 году вспышка лихорадки Ласса в Нигерии мобильная команда секвенирования использовала MinION для генерации вирусных геномов и подтверждения наличия вируса Ласса в подозрительных случаях, исключая другие геморрагические лихорадки. Способность секвенировать весь геном в поле помогает различать импортные случаи и местную передачу, отслеживать появление лекарственной устойчивости и направлять разработку вакцины. В R&D Blueprint Всемирной организации здравоохранения выделено портативное секвенирование как приоритетная технология для готовности к пандемии.

Наблюдение за устойчивостью к противомикробным препаратам

Устойчивость к противомикробным препаратам (AMR) является глобальным кризисом в области здравоохранения, и наблюдение за генами устойчивости имеет важное значение для руководства лечением. Портативное секвенирование позволяет проводить скрининг AMR в больницах с низкими ресурсами, фермах и даже сточных водах. Исследователи могут секвенировать бактериальные изоляты или метагеномную ДНК из клинических или экологических образцов и обнаруживать гены устойчивости против баз данных, таких как CARD или ResFinder. В исследовании, проведенном в Таиланде, команда использовала MinION в сельской клинике для выявления штаммов Klebsiella pneumoniae, несущих гены карбапенемазы, обеспечивая действенные результаты менее чем за шесть часов — намного быстрее, чем традиционные методы, основанные на культуре. Расширение такой способности к настройкам на основе точки ухода может революционизировать инфекционный контроль и управление антибиотиками.

Эпидемиология на основе сточных вод

Слежка за сточных вод SARS-CoV-2 стала ключевым инструментом общественного здравоохранения во время пандемии. Портативное секвенирование позволило проанализировать образцы сточных вод в отдаленных общинах, где отправка образцов в центральную лабораторию нецелесообразна. В 2021 году исследователи в Уганде развернули MinION для секвенирования фрагментов SARS-CoV-2 из сточных вод в Кампале, генерируя данные о вариантах, которые информировали о местном ответе на COVID-19. Тот же подход адаптируется для наблюдения за полиомиелитом, гриппом и УПП. Портативное секвенирование сокращает время оборота от недель до дней, позволяя почти в реальном времени контролировать инфекции на уровне населения.

Проблемы и ограничения

Несмотря на значительный прогресс, переносное геномное секвенирование не лишено значительных проблем, которые необходимо решать для широкого и надежного развертывания на местах.

Срок службы батареи и электроснабжение

Секвенирование требует непрерывной мощности как для устройства, так и для подключенного компьютера (если не использовать интегрированные модели, такие как Mk1C). В удаленных полевых участках доступ к сетевому электричеству может отсутствовать. В то время как солнечные панели и портативные банки питания могут помочь, энергетические потребности базового календаря в реальном времени на ноутбуке могут быстро истощать батареи. Для расширенного развертывания (недели или месяцы) управление питанием становится критической логистической проблемой. Последние разработки в области маломощных вычислений, таких как процессоры на основе ARM и энергоэффективные чипы базового календаря, обещают расширить операционную автономность, но проблема не полностью решена.

Хранение данных и их связь

Портативные секвенсоры генерируют большие объемы необработанных данных. Типичный запуск MinION производит десятки гигабайт файлов электрических сигналов (формат FAST5 или POD5). Хранение, передача и анализ этих данных на ноутбуке с ограниченным хранилищем является сложной задачей. В области подключение к Интернету часто плохо или отсутствует, предотвращая облачный анализ. Исследователи должны носить внешние жесткие диски или использовать портативные вычислительные устройства с достаточной мощностью ОЗУ и GPU. Кроме того, необходимость тщательного контроля качества и биоинформатики трубопроводов означает, что полевые ученые часто требуют существенного обучения анализу данных. Офлайновые инструменты базирования и анализа, такие как платформа EPI2ME (которая может работать локально), улучшают ситуацию, но удобное для пользователя решение «все в одном» остается целью.

Целостность выборки и условия окружающей среды

Полевые образцы часто смешиваются, низкоконцентрируются или деградируют из-за тепла, влажности или химического воздействия. Портативный секвенсор сам должен выдерживать пыль, влагу, вибрацию и экстремальные температуры. В то время как MinION и Flongle достаточно прочны, связанная с ними электроника (ноутбуки, источники питания) более хрупкие. Специализированные корпуса и закаленные в полевых условиях компьютеры доступны, но добавляют стоимость и вес. Кроме того, реагенты (ферменты, буферы, проточные клетки) имеют ограниченный срок службы и часто требуют холодного хранения. Исследователи в тропическом климате сталкиваются с проблемой сохранения реагентов прохладными без надежного охлаждения - проблема, которая стимулировала развитие ферментов, высушенных в морозильной камере, и стабильные наборы комнатной температуры, но они еще не универсальны.

Точность и пропускная способность

Секвенирование нанопор сделало большие успехи в точности, но согласованная точность для портативных запусков - особенно в полевых условиях с ограниченным контролем температуры и качества образца - все еще может отставать от секвенирования Illumina для определенных применений. Хотя точность одномолекулярного секвенирования высока (теперь более 99% для высококачественных считываний), ошибки, как правило, систематически в гомополимерных областях. Для приложений, требующих однонуклеотидного разрешения, таких как обнаружение низкочастотных мутаций или вызова варианта в клинических контекстах, может потребоваться дополнительная проверка. Пропускная способность также ограничена: одна проточная клетка MinION обычно дает 10-20 ГБ данных, достаточных для многих бактериальных геномов, но не для глубокого метагеномного профилирования сложных сообществ. Проточные клетки повторно используются в пределах, но стоимость на образец все еще может быть высокой для крупномасштабных исследований.

Обучение и экспертиза

В то время как портативное секвенирование более доступно, чем традиционное лабораторное секвенирование, оно по-прежнему требует значительных знаний. Полевые исследователи должны изучать извлечение ДНК, подготовку библиотеки, загрузку проточных ячеек, базисный калькулятор и анализ биоинформатики. Кривая обучения крута, и многие проекты полагаются на небольшое количество обученных людей. Усилия по упрощению рабочих процессов (например, подход «plug-and-play» SmidgION) продолжаются, но в обозримом будущем портативное геномное секвенирование останется специализированным навыком. Разработка интуитивно понятного программного обеспечения, автоматизированных устройств для подготовки образцов и безоблачных аналитических трубопроводов имеет решающее значение для расширения принятия среди неэкспертных пользователей.

Будущие направления и инновации

Область портативного геномного секвенирования быстро развивается, и на горизонте есть несколько интересных разработок, которые обещают устранить текущие ограничения и расширить приложения.

Интеграция искусственного интеллекта для анализа в реальном времени

Искусственный интеллект (ИИ) и машинное обучение интегрируются в алгоритмы базового календаря и анализа по нисходящему потоку. Например, исследовательская группа, стоящая за базовым календарем Guppy (теперь Bonito), включила повторяющиеся нейронные сети и модели трансформаторов для повышения точности и скорости. В будущем ИИ может включить вызов варианта на устройстве, идентификацию видов и даже функциональную аннотацию неизвестных последовательностей. Представьте себе полевого исследователя, выполняющего образец почвы и получающего отчет об «обнаруженных 12 бактериальных семействах, включая большое количество азотфиксирующих видов» в течение нескольких минут после запуска секвенирования. Облачная связь может не потребоваться, если модели хранятся локально на устройстве или парном смартфоне. Достижения в краевом ИИ, такие как Coral TPU от Google, могут принести эту возможность портативным секвенсорам в течение нескольких лет.

Улучшенная надежность и автономность устройства

Производители работают над полностью интегрированными автономными устройствами секвенирования, которые объединяют проточную ячейку, флюидику, источник питания и вычисления в одном прочном блоке. MinION Mk1C Оксфорда Nanopore уже интегрирует компьютер, но будущие итерации могут включать в себя более крупные батареи, твердотельное хранилище и передачу спутниковых данных. Некоторые стартапы изучают устройства размером с ладонь, которые используют микрофлюидики для автоматизации подготовки библиотеки, сокращения практического времени и необходимости лабораторных навыков. Устройства, предназначенные для суровых условий (IP67, рабочая температура от -20 ° C до 50° C), могут сделать секвенирование возможным в местах, где современные устройства борются.

Расширенные применения в сельском хозяйстве и безопасности пищевых продуктов

Портативные секвенсоры, вероятно, станут стандартными инструментами для сельскохозяйственных полевых испытаний, позволяя селекционерам выполнять геномный отбор на ходу. Фермеры могут тестировать микробиомы почвы для оптимизации использования удобрений, раннего выявления патогенов растений и отслеживания загрязнения в цепочке поставок продуктов. Например, портативный секвенсор на объекте упаковки продуктов может проверять загрязнение Сальмонелла или E. coli в воде или на поверхностях продуктов, обеспечивая результаты до отправки продуктов. Возможность сочетать портативное секвенирование с портативной ПЦР (например, система Biomeme) создает мощную полевую диагностическую платформу для органов по безопасности пищевых продуктов.

Геномика сохранения и биобанкинг

По мере ускорения утраты биоразнообразия геномика сохранения все больше опирается на неинвазивную выборку и генетический мониторинг в режиме реального времени. Портативное секвенирование может поддержать создание «генетических ваучеров» для полевых образцов, что позволит быстро идентифицировать виды и популяционную генетику без необходимости транспортировки образцов. В контексте биобанкинга — сохранения генетического материала из исчезающих видов — переносные секвенсоры могут проверять идентичность и целостность образцов до их криоконсервации, снижая риск неправильной маркировки или деградации. Развитие портативного секвенирования как инструмента для действий по сохранению in situ будет ключевым направлением в предстоящем десятилетии.

На пути к по-настоящему универсальной, недорогой платформе

Конечная цель портативного геномного секвенирования состоит в том, чтобы сделать его таким же распространенным, как смартфон или цифровая камера в полевых исследованиях. Это требует постоянного снижения стоимости - как авансовых, так и на выборку - и улучшения простоты использования. Oxford Nanopore Flongle стоит всего 90 долларов за проточную ячейку (хотя и с более низкой пропускной способностью), и компания объявила о планах устройства стоимостью менее 300 долларов. Между тем, конкуренты, такие как GenoCare из Direct Genomics (с использованием одномолекулярного секвенирования путем синтеза) и платформа Qnome из Quantum-Si (белковое секвенирование) раздвигают границы переносного анализа нуклеиновых кислот и белков. Сближение нескольких портативных технологий анализа - геномики, транскриптомики, протеомики - в одном портативном устройстве может трансформировать то, как мы понимаем биологические системы за пределами лаборатории.

Заключение

Развитие портативных устройств геномного секвенирования коренным образом изменило то, что возможно в полевых исследованиях. От отслеживания Эболы в Западной Африке до секвенирования микробиома антарктической рыбы эти компактные инструменты доказали, что геномный анализ больше не требует лаборатории кирпичей и минометов. Преимущества глубоки: более быстрые результаты, более низкие затраты, большая доступность и способность принимать решения, основанные на данных, в режиме реального времени. Однако проблемы остаются с точки зрения точности, мощности, управления данными и обучения. По мере того, как технологии продолжают развиваться - движимые улучшениями в химии нанопор, ИИ, дизайн устройства и упрощение рабочего процесса - барьеры будут продолжать падать. В ближайшие годы портативное секвенирование станет неотъемлемым инструментом для экологов, эпидемиологов, защитников природы и ученых-аграриев во всем мире, позволяя исследования, которые ранее были невозможны и углубляя наше понимание жизни во всех ее формах в каждой среде на Земле.

Для дальнейшего чтения посетите веб-сайт Oxford Nanopore Technologies nanoporetech.com, протоколы полевого секвенирования сети ARTIC artic.network и штрих-код системы данных о жизни boldsystems.org.