Роль биофизических компонентов в дифференцировке стволовых клеток для восстановления органов

Потенциал терапии стволовыми клетками для регенерации поврежденных органов и тканей пленял биомедицинские исследования в течение десятилетий. В то время как ранние усилия были сосредоточены почти исключительно на биохимических сигналах - факторах роста, цитокинах и небольших молекулах - растущее количество доказательств показывает, что физическая среда оказывает столь же глубокий контроль над судьбой стволовых клеток. Биофизические сигналы, включая механические силы, жесткость субстрата и топографические особенности, организуют сложный процесс дифференциации, привлекая клеточные механосенсоры и нижестоящие сигнальные сети. Понимание того, как эти сигналы направляют решения стволовых клеток, имеет важное значение для разработки эффективных стратегий тканевой инженерии, которые могут восстановить функцию в неисправных органах.

Природа биофизических сигналов

Биофизические сигналы представляют физические свойства клеточной микросреды, которые клетки ощущают и реагируют посредством механотрансдукции. В отличие от растворимых химических сигналов, эти сигналы возникают из внеклеточного матрикса (ECM), соседних клеток и внешних механических нагрузок. Клеточный ответ на эти сигналы не является пассивным; живые клетки активно исследуют свое окружение, оказывая на матрицу сократительные силы и соответствующим образом корректируя свое поведение. Три основные категории биофизических сигналов — механические силы, жесткость субстрата и топографические особенности.

Механические силы

Циклическая растяжка в сердечной и скелетной мышцах, сжатие в костной и хрящевой ткани, стрижность от кровотока в сосудистой системе - все это физиологические примеры. Эти силы передаются через ECM и клеточные соединения в цитоскелет, вызывая внутриклеточные сигнальные каскады. В дифференцировке стволовых клеток механические силы могут направлять спецификацию линии. Например, приложенная циклическая растяжка на физиологических амплитудах способствует дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в сторону гладкой мышцы или фенотипа сердца. Стрижность, с другой стороны, является мощным стимулом для дифференциации эндотелиальных клеток из стволовых и клеток-предшественников, критическим шагом для сосудистой регенерации.

Стильный субстрат

Механическая жесткость внеклеточного субстрата является одним из наиболее хорошо характеризуемых биофизических сигналов. Нативные ткани демонстрируют широкий диапазон значений жесткости, от мягкой ткани мозга (сотни Паскалей) до жесткой кости (несколько гигапаскалей). Стволовые клетки, встроенные или культивируемые на матрицах различной жесткости, подвергаются дифференцировке по линии. Семинальная работа Энглера и его коллег продемонстрировала, что MSC, культивируемые на мягких матрицах, которые имитируют ткань мозга, становятся нейрогенными, на более жестких матрицах, которые имитируют мышцы, становятся остеогенными, и на жестких матрицах, которые имитируют костную ткань. Эта дифференциация, направленная на жесткость, опосредуется сократимостью немышечного миозина II и механочувствительными факторами транскрипции YAP и TAZ.

Топографические особенности

Поверхностная топография внеклеточной среды, включая такие особенности, как канавки, гребни, столбы и волокна, обеспечивает другой слой биофизической информации. Клетки выравниваются к наномасштабным и микромасштабным образцам, явление, известное как контактное наведение. Выровненные субстраты могут ориентировать оси деления клеток и влиять на дифференцировку. Например, выровненные нановолокна способствуют созреванию клеток Шванна и росту нейрита для нейронного восстановления, в то время как микроструктурированные поверхности могут усиливать остеогенную дифференцировку МСК. Топография также может модулировать адгезию клеток, распространение и ядерную форму, что, в свою очередь, влияет на экспрессию генов.

Механизмы механотрансдукции

Процесс, посредством которого клетки преобразуют физические стимулы в биохимические реакции, называется механотрансдукцией. Он включает в себя сеть молекулярных датчиков, преобразователей и эффекторов, которые работают совместно, чтобы регулировать экспрессию генов и, в конечном счете, судьбу клеток. Понимание этих путей имеет решающее значение для рационального проектирования биофизических сигналов для дифференциации стволовых клеток.

Интегрин-медиированная адгезия и сигналы фокальной адгезии

Клетки прикрепляются к ECM через рецепторы интегрина, которые группируются при очаговых адгезиях. Когда применяются внешние силы или когда изменяется жесткость субстрата, интегрины активируют фокальную адгезионную киназу (FAK) и семейство киназ Src. Эти сигналы распространяются на цитоскелет — в первую очередь актиновые нити — и модулируют активность Rho GTPases, таких как RhoA, Rac1 и Cdc42. Сжатость, управляемая Rho, опосредованная Rho-ассоциированной киназой (ROCK) и немышечным миозином II, является центральным для восприятия жесткости. Повышенная жесткость матрицы приводит к повышенной сократимости, способствуя ядерной транслокации YAP и TAZ, которые приводят к транскрипции про-остеогенных генов, таких как RUNX2.

Факторы транскрипции YAP/TAZ

YAP (Yes-ассоциированный белок) и TAZ (транскрипционный коактиватор с мотивом связывания PDZ) являются ядерными механотрансдукторами, локализация которых исключительно чувствительна к механической среде. На жестких субстратах YAP/TAZ являются ядерными и активными, способствуя пролиферации и дифференциации в сторону линий, требующих высокой сократимости (например, кости). На мягких субстратах YAP/TAZ являются цитоплазматическими и неактивными, отдавая предпочтение нейронным или адипогенным судьбам. YAP/TAZ взаимодействуют с факторами транскрипции TEAD для регулирования генов-мишеней, участвующих в клеточном цикле, ремоделировании ECM и спецификации линии. Этот путь теперь является центральной мишенью в стратегиях контроля судьбы стволовых клеток с использованием биоматериалов.

Цитоскелетная динамика и ядерная механика

Актин цитоскелет физически связывает внеклеточную среду с ядром через комплекс LINC (линкер нуклеоскелета и цитоскелета). Силы, передаваемые через актиновые нити и промежуточные нити, могут непосредственно деформировать ядро, изменяя организацию хроматина и экспрессию генов. Например, ядерное сплющивание на жестких субстратах может открывать гетерохроматиновые области, позволяя факторам транскрипции получить доступ к генам, специфичным к линии. Эта механоядерная связь объясняет, как биофизические сигналы могут оказывать длительное воздействие на память стволовых клеток и потенциал дифференцировки.

Применение в ремонте органов

Способность направлять дифференцировку стволовых клеток путем манипулирования биофизическими сигналами открыла новые возможности для восстановления конкретных органов.Тканевые инженерные каркасы и биореакторы предназначены для повторного использования физической среды целевой ткани, тем самым улучшая интеграцию и функциональность трансплантированных клеток.

Ремонт сердца

Сердечная недостаточность после инфаркта миокарда остается ведущей причиной смертности. Сердечная ткань непрерывно находится под циклическим механическим напряжением, а жесткость здорового миокарда составляет примерно 10-20 кПа, увеличиваясь после инфаркта. Для регенерации функциональной сердечной мышцы исследователи применили циклический растяжек к кардиомиоцитам эмбриональных стволовых клеток или индуцированным плюрипотентным кардиомиоцитам стволовых клеток во время культивирования. Было показано, что растяжение при 10-20% удлинении при 1 Гц повышает саркомерную организацию и обработку кальция, улучшая сократительный выход. Кроме того, каркасы с жесткостью, соответствующие родному миокарду (мягкий, но эластичный), уменьшают аритмогенные побочные эффекты и способствуют стабильной интеграции трансплантата. Комбинаторные подходы с использованием выровненных нановолокон и динамической механической нагрузкой в настоящее время тестируются на крупных моделях животных.

Нейронная регенерация

Восстановление поврежденной ткани головного или спинного мозга требует нейронов, которые могут образовывать соответствующие синаптические связи. Центральная нервная система чрезвычайно мягкая (0,1-1 кПа), и стволовые клетки реагируют на эту мягкость дифференцированием в нейроны, а не глии. Гидрогели с настраиваемой жесткостью в мягком диапазоне, часто в сочетании с нейротрофическими факторами, использовались для направления нейронных клеток-предшественников к нейронной судьбе. Топографические сигналы, такие как выровненные электроспунированные волокна, направляют аксональный рост и направляют ориентацию регенерирующих нервных пучков. В моделях повреждения спинного мозга каркасы, которые представляют как мягкую механику, так и выровненную топографию, поддерживают функциональное восстановление путем содействия аксональной регенерации и ремиелинизации.

Ремонт костей и хряща

Костная ткань является жесткой, и остеогенная дифференциация предпочтительна на жестких субстратах (упругий модуль > 25 кПа). Керамика на основе фосфата кальция и жесткие полимерные каркасы обычно используются для доставки МСК для регенерации костей. Однако недавние работы показывают, что динамическая сжимающая нагрузка, имитирующая физиологическую ходьбу, дополнительно усиливает экспрессию остеогенных генов и минерализацию матрицы. Для восстановления хряща задача состоит в поддержании хондрогенного фенотипа при предотвращении гипертрофии. Было показано, что мягкие гидрогели (0,5-5 кПа) с прерывистым динамическим сжатием подавляют остеогенные маркеры и способствуют производству коллагена II типа и аггрекана, ключевых компонентов суставного хряща.

Васкулирование

Успешное восстановление органов зависит от функционального кровоснабжения. Эндотелиальные клетки могут быть получены из стволовых клеток, подвергая их сдвиговому стрессу в микрофлюидных каналах или вращающихся биореакторах. Стресс сдвига жидкости активирует рецептор эндотелиального фактора роста 2 сосудов (VEGFR2) и способствует образованию капиллярных сетей. Комбинирование сдвига стресс с жесткими сосудистыми каркасами (например, поликапролактоном) и градиентами фактора роста создает предваскуляризированные конструкции, которые быстро анастомозируют с сосудистой системой хозяина при имплантации, что является критическим требованием для толстых тканевых трансплантатов.

Создание внеклеточной микросреды

Практическое воплощение биофизических сигналов в клинической терапии зависит от способности точно управлять микросредой, что включает в себя выбор соответствующих биоматериалов и разработку систем культуры, которые могут доставлять желаемые физические сигналы с течением времени.

Биоматериал дизайн жесткости и топографии

Натуральные полимеры, такие как коллаген, фибрин и гиалуроновая кислота, а также синтетические полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полиакриламид, могут быть сшиты для достижения диапазона значений жесткости. Фотосшиваемые гидрогели позволяют пространственно-временный контроль жесткости, позволяя динамическую мимикрию развития ткани. Топографические особенности могут быть введены электроспиннингом, микроформованием или трехмерной (3D) печатью. Например, расплав электрописьма производит каркасы с точно расположенными микроволокнами, которые направляют выравнивание клеток. Последние достижения в 4D-печати, где форма каркаса изменяется в ответ на стимулы, открывают возможности для доставки биофизических сигналов, которые развиваются после имплантации.

Биореакторные системы для механического кондиционирования

Биореакторные системы обеспечивают контролируемую среду, в которой одновременно могут применяться множественные биофизические сигналы. Для сердечной тканевой инженерии циклические растяжные биореакторные системы применяют биаксиальный или одноосный штамм. Для костей перфузионные биореакторные системы сочетают в себе напряжение сдвига жидкости с нагрузкой на сжатие. Эти системы не только улучшают дифференцировку, но и усиливают осаждение матрицы и созревание тканей. Автоматизированные биореакторные системы также позволяют масштабировать клиническое производство, что является важным шагом для коммерческой жизнеспособности. Последние биореакторные системы с контролем в реальном времени кислорода, pH и механических свойств проверяются на соответствие надлежащей производственной практике (GMP).

Проблемы и ограничения

Несмотря на многообещающие биофизические подходы, некоторые препятствия остаются до широкого клинического применения.

Масштабируемость и воспроизводимость

Создание согласованных биофизических микросред на большом количестве имплантатов является сложной задачей. Степень жесткости, пористости и топографии каркасов может привести к непоследовательным результатам дифференциации. Разрабатываются передовые методы контроля качества, такие как высокопроизводительное механическое тестирование и автоматизированный анализ изображений, но они еще не являются стандартными. Аналогичным образом, протоколы биореакторов должны быть оптимизированы для предотвращения гибели клеток от чрезмерной силы или градиентов питательных веществ.

Неоднородность клеточных популяций

Популяции стволовых клеток, даже от одного донора, проявляют внутреннюю гетерогенность в своей реакции на биофизические сигналы. Секвенирование РНК одноклеточных показало, что субпопуляции МСК имеют различную механочувствительность из-за различных уровней экспрессии интегрина или активности YAP. Эта неоднородность может привести к смешанным фенотипам внутри трансплантата, снижая общую функцию. Сортировка клеток на основе механических свойств (например, использование микрофлюидики для изоляции клеток с высокой сократимостью) может улучшить однородность, но эти методы все еще находятся в раннем развитии.

Перевод в Vivo

Механическая среда живого организма динамична и сложна. Имплантированные каркасы подвержены воспалительным реакциям, деградации матриц и ремоделированию клетками-хозяевами, что может изменять намеченные биофизические сигналы. Например, жесткость каркаса может со временем ухудшаться, или фиброзная инкапсуляция может ограждать стволовые клетки от желаемых механических сил. Стратегии смягчения этих проблем включают использование ферментативно разлагаемых сшивателей, которые позволяют опосредованное клетками ремоделирование или покрытие каркасов иммуномодулирующими молекулами. Для понимания того, как развиваются биофизические сигналы после имплантации, необходимы долгосрочные исследования in vivo с несколькими временными точками.

Будущие направления

В следующем десятилетии исследования, вероятно, будут сосредоточены на интеграции биофизических сигналов с другими регуляторными сигналами и персонализации методов лечения для отдельных пациентов.

Комбинаторные и динамические сигналы

Природа редко использует один сигнал в изоляции. Появляющиеся биореакторы могут применять сложные, изменяющиеся во времени комбинации растяжения, сдвига и жесткости. Например, многоканальное микрожидкостное устройство может подвергать клетки последовательным изменениям жесткости и перфузии, имитируя развитие сердца от эмбриона до взрослого. Используются алгоритмы машинного обучения для оптимизации этих многопараметрических систем, выявления точной последовательности и величины сигналов, которые максимизируют дифференциацию к целевой линии.

Персонализированная медицина и перепрограммирование in vivo

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки пациента (iPSC) уже обещают аутологическую трансплантацию. Сочетание технологии iPSC с полученной пациентом ECM - например, путем децеллюляризации биопсии из поврежденного органа - может создать каркасы, которые представляют как биохимические, так и биофизические сигналы, идентичные нативной ткани. Кроме того, исследователи изучают возможность использования биофизических сигналов самостоятельно, без посторонних клеток, для перепрограммирования эндогенных стволовых клеток in situ. Инъекционные гидрогели, которые застывают или размягчаются в ответ на температуру тела или рН, могут набирать местные клетки-предшественники и направлять их дифференцировку для восстановления ткани изнутри. Хотя все еще доклинические, такие подходы могут устранить необходимость трансплантации клеток в целом.

В конечном счете, успех терапии стволовыми клетками для восстановления органов зависит от глубокого понимания того, как клетки интерпретируют свой физический мир. Проектируя биоматериалы и системы культуры, которые точно воспроизводят биофизическую среду развивающихся и взрослых тканей, мы можем управлять судьбой стволовых клеток с беспрецедентной точностью. Интеграция механобиологии с тканевой инженерией - это не просто академическое упражнение - это необходимый шаг к реализации клинического обещания регенеративной медицины. По мере того, как эти технологии созревают, способность исцелять некогда непоправимое повреждение органов перейдет из лаборатории к постели, предлагая новую надежду для пациентов с сердечной недостаточностью, травмой спинного мозга, остеоартритом и бесчисленными другими состояниями, коренящимися в потере ткани или дисфункции.