3d Биопечать сложных сосудистых сетей для тканевой инженерии

Трехмерная биопечать появилась как трансформирующая технология в тканевой инженерии, позволяющая строить живые конструкции, имитирующие архитектуру и функцию нативных тканей. Среди наиболее важных вех в этой области является изготовление сложных сосудистых сетей - иерархических, перфузионных каналов, которые доставляют кислород и питательные вещества при удалении метаболических отходов. Без функциональной сосудистой системы, инженерные ткани остаются ограниченными тонкими, сосудистыми структурами, которые не могут выжить за пределами предела диффузии приблизительно 200 микрометров. Последние достижения в аппаратном обеспечении биопечати, химии биоинков и методах культуры тканей привели к цели создания трансплантируемых, васкуляризированных тканей ближе к клинической реальности.

Критическая роль сосудообразования в тканевой инженерии

Сосударизация — это процесс, посредством которого развиваются сети кровеносных сосудов в тканях. В естественных условиях каждая клетка находится в пределах нескольких сотен микрометров капилляра, обеспечивая эффективный массовый транспорт. Когда инженерные ткани in vitro, репликация этой сети является единственным самым большим препятствием для создания объемных конструкций. Без перфузионных кровеносных сосудов клетки в интерьере каркаса страдают от гипоксии, лишения питательных веществ и накопления отходов, что приводит к некрозу. Это ограничение диффузии объясняет, почему большинство тканеинженерных продуктов на сегодняшний день были ограничены тонкими тканями, такими как кожа, хрящ и мочевой пузырь.

Для толстых, метаболически активных органов, таких как печень, почки или сердце, встроенное сосудистое снабжение не подлежит обсуждению. Развитие эффективных сосудистых сетей является поэтому ключом к масштабированию тканевой инженерии от небольших имплантатов до целых органов.

Кроме того, сосудистые сети являются не просто пассивными каналами; они активно регулируют гомеостаз тканей посредством сигнализации эндотелиальных клеток, барьерной функции и иммунной модуляции. Успешная тканевая конструкция должна интегрироваться с сосудистой системой хозяина для обеспечения долгосрочного выживания. Ранние попытки основывались на спонтанном образовании сосудов через ангиогенез, медленный процесс, который часто не проникает в толстые конструкции до возникновения центрального некроза. 3D-биопечать предлагает решение путем непосредственного изготовления сосудистых шаблонов, которые могут быть эндотелиализированы и подключены к циркуляции хозяина, резко ускоряя процесс васкуляризации.

Технологические достижения в 3D-биопечати для сосудистой конструкции

Современные технологии биопечати эволюционировали, чтобы удовлетворить требования сосудистой тканевой инженерии. Каждая техника предлагает различные компромиссы в разрешении, скорости, жизнеспособности клеток и совместимости материалов. Исследователи обычно используют один или несколько из следующих методов, часто в сочетании с жертвенными или вспомогательными материалами.

Биопечать на основе экструзии

Экструзионная биопечать является наиболее широко используемым методом для сосудистых применений. Она работает путем раздачи биоинки через сопло с использованием пневматического или механического давления. Этот метод может осаждать высоковязкие материалы, включая гидрогели и термопластичные полимеры, позволяющие создавать большие, механически прочные структуры. Для сосудистого изготовления экструзия часто используется для печати жертвенных ядер - обычно желатиновых, плуроновых F127 или углеводного стекла - которые позже удаляются, чтобы оставить полые каналы. Полученный просвет затем можно засеять эндотелиальными клетками для создания функциональной оболочки сосуда.

Разрешение экструзионной печати обычно колеблется от 100 до 500 микрометров, подходит для средних и больших сосудов, но еще не для сетей капиллярного масштаба.

Инъекционная биопечать

Инъекционная биопечать обеспечивает более высокое разрешение и более высокую скорость печати, выбрасывая капли пиколитра с низкой вязкостью биоинка на подложку. Тепловые или пьезоэлектрические приводы контролируют образование капель, позволяя точно размещать клетки и биоматериалы. В то время как струйная печать может достигать разрешений до 20–50 микрометров, ее зависимость от чернил с низкой вязкостью ограничивает механическую прочность печатных конструкций. Для сосудистых применений струйная печать часто используется для узора эндотелиальных клеток в предварительно сформированных гидрогелевых каркасах или для нанесения факторов роста, которые направляют ангиогенез. Она менее подходит для печати стенок отдельных сосудов, но превосходит создание клеточных узоров, которые способствуют самосборке сосудов.

Лазерная биопечать

Лазерная биопечать использует импульсный лазер для переноса биоинки из донорской ленты на принимающую подложку. Этот подход без сопла устраняет напряжение сдвига, достигая высокой жизнеспособности клеток (часто > 95%) и отличного разрешения (до 10-20 микрометров). Он особенно ценен для печати деликатных типов клеток, таких как эндотелиальные и стволовые клетки, в точных аранжировках. Однако процесс относительно медленный и дорогой, ограничивая его масштабируемость. Исследователи использовали лазерную биопечать для создания разветвленных сосудистых паттернов на плоских поверхностях и для нанесения эндотелиальных клеток по заранее заданным путям, которые позже объединяются в трубчатые структуры.

Метод лучше всего подходит для исследовательских приложений, требующих тонкого пространственного контроля, а не крупномасштабного производства.

Стереолитография и цифровая обработка света

Хотя менее распространенные, чем экструзия, методы на основе фотополимеризации, такие как стереолитография (SLA) и цифровая обработка света (DLP), набирают тягу для сосудистого изготовления. Эти методы используют ультрафиолетовый или видимый свет для лечения слоя биоинки послойно, достигая разрешения ниже 50 микрометров. Включая фотоабсорберы и используя жертвенные каналы, исследователи создали сложные сети с гладкими люменами и высокой точностью. Основным ограничением является необходимость фотоотверждаемых биоинков, которые могут быть токсичными для клеток или требуют строгой оптимизации. Тем не менее, биопечать DLP продемонстрировала способность создавать перфузионные сосудистые конструкции с диаметрами каналов до 100 микрометров, открывая новые возможности для капиллярных сетей.

Биоинковые формулы и материаловедение для сосудистой биопечати

Успех любой стратегии биопечати критически зависит от биочернил — гидрогеля или композитного материала, который служит печатной средой и клеточным каркасом. Для сосудистых применений биочернила должны удовлетворять нескольким противоречивым требованиям: они должны быть напечатаны с высокой точностью формы, поддерживать адгезию и пролиферацию клеток, допускать диффузию питательных веществ и разрушаться со скоростью, соответствующей ремоделированию тканей. Текущие биочернила делятся на несколько категорий.

Естественные лягушки

Материалы, полученные из внеклеточного матрикса, такие как коллаген, желатин, фибрин, альгинат и гиалуроновая кислота, обеспечивают присущую биосовместимость и поддерживают функцию клеток. Коллаген и фибрин часто используются для инкапсуляции эндотелиальных клеток и поддерживают образование люмен-подобных структур. Гелатиновый метакрилоил (GelMA) сочетает биоактивность желатина с фотосшиваемостью, что делает его совместимым с SLA и DLP печатью. Алгинат, полученный из морских водорослей, легко сшивается с ионами кальция, но не имеет мотивов адгезии клеток, часто требующих модификации с пептидами RGD. В то время как природные гидрогели превосходят имитацию нативного ECM, их механическая прочность часто неадекватна для перфузионных каналов, что требует усиления жертвенными материалами или синтетическими полимерами.

Жертвенные биоинки

Мощная стратегия создания полых каналов заключается в печати временного, жертвенного материала, который может быть удален после того, как окружающая матрица была сшита. Общие жертвенные чернила включают Pluronic F127 (термообратимый гель, который сжижается при низкой температуре), желатин (снятый при нагревании) и углеводное стекло (растворенное в среде клеточной культуры). Жертвенная сеть печатается в желаемом сосудистом рисунке, встроенном в гидрогель, нагруженный клетками, а затем эвакуируется, чтобы оставить растворимый просвет. Этот подход позволяет создавать сложные, разветвляющиеся каналы, не требуя, чтобы стенки сосуда были напечатаны непосредственно. Эндотелиальные клетки могут быть позже засеяны в каналы для создания функциональной подкладки.

Децеллюляризированные внеклеточные матрицы Bioinks

Биоинки с децеллюляризированным внеклеточным матриксом (ДЭЦМ) получают путем удаления клеточных компонентов из нативных тканей (например, сердца, печени, жиров) при сохранении тканеспецифических матричных белков и факторов роста. Эти биоинки обеспечивают биохимическую среду, близко напоминающую среду целевого органа, способствуя дифференцировке клеток и организации тканей. Для сосудистых применений биоинки с ДЭЦМ использовались для печати конструкций, содержащих перфузионные каналы, которые поддерживают рост и созревание эндотелиальных клеток. Основной проблемой является изменчивость между партиями и трудность настройки механических свойств без потери биоактивности.

Проблемы создания функциональных сосудистых сетей

Несмотря на значительный прогресс, остается несколько препятствий, прежде чем 3D-биопечатные сосудистые сети могут быть регулярно использованы в клинической тканевой инженерии.Решение этих проблем требует междисциплинарного сотрудничества между инженерами, биологами и клиницистами.

Кислород и питательный транспорт

Даже при распечатанной сосудистой сети массовый транспорт кислорода и питательных веществ ограничен в ткани между сосудами. В нативных тканях капилляры расположены примерно на расстоянии 20–50 микрометров друг от друга. Текущая технология биопечати может производить каналы с интервалами 100–500 микрометров, оставляя большие участки ткани, которые должны полагаться на диффузию. Это несоответствие может привести к гипоксическим ядрам в толстых конструкциях. Исследователи изучают такие стратегии, как преваскуляризация в биореакторах, совместное печатание с кислород-генерирующими соединениями и использование микрофлюидных сетей, которые имитируют капиллярные слои более близко.

Однако репликация полной плотности микроваскулатуры остается большой проблемой.

Механическая стабильность и интеграция

Биопечатные сосуды должны выдерживать механические силы перфузии, включая напряжение сдвига и гидростатическое давление, без разрушения или разрыва. Гидрогели, обычно используемые для биопечати, имеют низкую жесткость, что делает их склонными к деформации под потоком. Укрепление стенок сосудов с градиентами концентрации сшивающего вещества, волокнистые добавки (например, нанофибриллированная целлюлоза) или совместное печать с биоразлагаемыми полимерами может улучшить стабильность. Кроме того, печатная сеть должна интегрироваться с сосудистой системой хозяина при имплантации. Анастомоз (хирургическая связь между печатными и нативными сосудами) технически требователен и часто выходит из строя из-за тромбоза или интимальной гиперплазии.

Преэндотелиализация каналов и использование антитромботических покрытий являются активными областями исследования.

Жизнеспособность клеток и их созревание

Сам процесс печати может поставить под угрозу жизнеспособность клеток из-за напряжения сдвига, засорения сопла и воздействия сшивающих агентов. Типичные жизнеспособность сразу после печати колеблются от 70% до 90%, в зависимости от техники и биоинки. Долгосрочная выживаемость требует, чтобы печатная конструкция была перфузирована в течение нескольких часов, прежде чем начнется гипоксия. После посева эндотелиальные клетки должны сформировать сливной монослой, принять покойный фенотип и производить компоненты мембраны подвала. Этот процесс созревания часто требует недель динамической культуры в биореакторе, который имитирует физиологический поток.

Медленное время созревания является узким местом для клинического перевода, где желательно наличие готовой продукции.

Масштабируемость и регуляторные препятствия

Переход от лабораторного производства к производству клинического класса создает значительные проблемы. Воспроизводимость, стерильность и контроль качества должны быть обеспечены для каждой печатной конструкции. Текущие биопринтеры могут производить конструкции размером в несколько сантиметров; масштабирование до целых органов потребует инноваций в параллельной печати, многоматериальном осаждении и неразрушающем мониторинге. Регулирующие органы, такие как FDA, разрабатывают рамки для медицинских устройств и клеточных продуктов, но путь к одобрению для васкуляризированной конструкции ткани длинный и неопределенный. Ранние применения могут сосредоточиться на более простых, менее метаболически требовательных тканях, таких как кость или хрящ, где васкуляризация все еще важна, но легче достичь.

Будущие направления и клинический перевод

Конечная цель биопечати васкуляризированных тканей заключается в создании трансплантируемых органов, которые могут заменить поврежденные или больные ткани. В то время как целые органы остаются на расстоянии нескольких лет, появляются более краткосрочные приложения.

Модели in vitro и тестирование лекарств

Биопечатные васкуляризированные ткани имеют непосредственную ценность как модели in vitro для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и фундаментальных исследований. Васкуляризированная печень или сердечная ткань могут пересчитать аспекты физиологии человека, которые отсутствуют в 2D-культурах или моделях на животных. Фармацевтические компании все чаще финансируют разработку таких моделей, чтобы уменьшить зависимость от тестирования на животных и улучшить прогнозируемость анализов на лекарства. Эти платформы также позволяют исследователям изучать сосудистые заболевания, такие как болезнь коронарных артерий и васкулит в контролируемой, относящейся к человеку среде.

Интеграция со стволовыми клетками

Сочетание 3D-биопечати с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPSCs) предлагает путь к специфическим для пациента васкуляризированным тканям. iPSCs могут быть дифференцированы в эндотелиальные клетки, перициты и паренхиматозные клетки, специфичные для органов, обеспечивая аутологичный источник клеток для печати. Этот подход может устранить необходимость иммуносупрессии после имплантации. Недавние исследования продемонстрировали печать эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, в перфузируемые каналы, которые экспрессируют функциональные маркеры. Задача состоит в достижении высоких номеров клеток и чистоты, необходимых для клинических конструкций, а также для обеспечения того, чтобы дифференцированные клетки поддерживали свой фенотип с течением времени.

Биореактор предварительная кондиционирование

Перед имплантацией печатные сосудистые конструкции получают пользу от кондиционирования в биореакторе, который применяет физиологический поток, давление и механические стимулы. Культура биореактора улучшает выравнивание клеток, осаждение матрицы и целостность сосудов. Достижения в перфузионных биореакторах, в том числе те, которые позволяют визуализировать в реальном времени и неинвазивное зондирование кислорода, ускоряют процесс созревания. Некоторые группы разработали переносные биореакторы, которые поддерживают жизнеспособность ткани во время транспортировки от производственного объекта в операционную, критический шаг для клинического принятия. Для получения дополнительной информации о конструкции биореактора для тканевой инженерии см. всеобъемлющий обзор, опубликованный в Биотехнология и биоинженерия .

Этические и нормативные соображения

По мере продвижения биопечати к испытаниям на людях необходимо решать этические вопросы, касающиеся источников тканей, согласия пациентов и справедливости доступа. Использование iPSCs вызывает обеспокоенность по поводу генетических манипуляций и опухолевости. Регулирующие органы разрабатывают руководство по комбинированным продуктам, которые включают живые клетки, биоматериалы и производственные устройства. Перспектива 2023 года в материалах Nature Reviews описывает ключевые вехи для клинического перевода, включая необходимость стандартизированной характеристики биоинков, проверенных протоколов стерильности и долгосрочных исследований на животных для оценки безопасности и эффективности. Ранние клинические испытания для более простых тканей (например, васкуляризированных костных трансплантатов) ожидаются в течение следующих пяти лет, с более сложными органами после десятилетия или более позже.

Заключение

3D-биопечать сложных сосудистых сетей представляет собой переломный момент в тканевой инженерии. Позволив создавать перфузионные каналы в живых конструкциях, исследователи преодолели один из самых грозных барьеров для создания толстых, метаболически активных тканей. В то время как проблемы в разрешении, механической стабильности, созревании клеток и масштабируемости сохраняются, темпы инноваций ускоряются. Такие методы, как жертвенная биопечать, стереолитография для каналов с высоким разрешением и использование биоинконструкций с децеллюляризированной матрицей, сближаются для создания конструкций, которые все больше напоминают родную сосудистую систему. В сочетании с достижениями в биологии стволовых клеток, дизайне биореактора и нормативной науке, эти технологии имеют потенциал для преобразования регенеративной медицины.

Путь от лабораторного стенда до операционной комнаты длинен, но конструкция васкуляризированной ткани - когда-то далекая мечта - теперь ощутимая и быстро прогрессирующая цель.