Биомеханическая оценка образцов биопсии костей с использованием наноидентификации

Введение: микромасштабные основы силы костей

Человеческая кость является динамическим композитным материалом, который должен уравновешивать жесткость с жесткостью, прочность с легкостью. В то время как клинические инструменты, такие как двухэнергетическая рентгеновская абсорбционометрия (DXA), измеряют минеральную плотность костей (BMD) для оценки риска переломов, только BMD объясняет только около 60-70% вариации прочности костей. Этот разрыв заставил исследователей исследовать внутренние механические свойства костной ткани на микромасштабе и наномасштабе. Наноидентификация возникла как главный метод исследования этих свойств непосредственно из образцов биопсии костей, предлагая беспрецедентные детали о жесткости, твердости и эластичности на уровне отдельных структурных единиц костей - остеонов, трабекул и даже одиночных ламелл.

Биомеханическая оценка образцов биопсии костей с использованием наноиндентации устраняет разрыв между материаловедением и клинической ортопедией. Путем количественной оценки реакции кости на контролируемые, локализованные нагрузки клиницисты и ученые могут лучше понять, как такие заболевания, как остеопороз, несовершенный остеогенез и болезнь Педжета, изменяют качество ткани. Эта расширенная статья предоставляет всеобъемлющий обзор методологии наноиндентации, проблемы подготовки образцов, ключевые приложения и будущие направления в исследованиях биомеханики костей.

Принципы наноидентификации

Наноиндентация, также известная как глубиночувствительная вмятость, измеряет механические свойства материала, нажимая жесткий измеритель известной геометрии (обычно алмазный наконечник Берковича) на поверхность образца при непрерывной записи нагрузки и смещения. Полученная кривая нагрузки-перемещения содержит богатую информацию: наклон разгрузочного сегмента может использоваться для расчета упругого модуля, в то время как максимальная нагрузка, разделенная областью контакта, дает твердость. Для вязкоупругих материалов, таких как кость, сегменты нагрузки и удержания также обеспечивают понимание зависящего от времени поведения (ползучесть и расслабление).

Исторический контекст и инструментарий

Методика, разработанная в 1990-х годах с развитием непрерывного измерения жесткости (CSM) и улучшенным разрешением силы / смещения. Современные наноинденторы могут применять силы от микроньютонов до сотен миллиньютонов с разрешением смещения порядка 0,2 нм. Ключевые приборы включают в себя:

Для более подробного обзора приборов и калибровки читатели ссылаются на образовательные ресурсы Nanomechanics Inc., которые описывают стандартный метод Оливера-Фарра, используемый в большинстве исследований костей.

Биопсия костей приобретение и обработка

Образцы костей для наноиндентации получают либо от пациентов-людей (обычно во время ортопедических процедур, таких как замена тазобедренного сустава или хирургия позвоночника), либо с животных моделей. Наиболее распространенными местами биопсии человека являются подвздошный гребень и головка бедра. Независимо от источника, тщательное обращение имеет первостепенное значение для сохранения нативного механического состояния ткани.

Подготовка образцов: встраивание и секция

Свежие образцы кости обычно фиксируются в формалине или этаноле для предотвращения деградации, затем обезвоживаются с помощью градуированных спиртовых растворов. Для наноиндентации образец должен быть встроен в эпоксидную или акриловую смолу низкой вязкости, которая проникает в пористую сеть. Встраивание обеспечивает механическую поддержку при резке и полировании, но не полностью проникает в минерализованную матрицу; поэтому внутренние свойства кости все еще можно измерить на глубине углубления в несколько сотен нанометров.

После встраивания блок секционируется с использованием низкоскоростной алмазной пилы для обнажения плоской поверхности. Окончательная полировка выполняется с постепенно более тонкими абразивами (до 0,05 мкм алюминиевой подвески) для достижения шероховатости поверхности менее 50 нм Ра. Шероховатость поверхности, превышающая 10% глубины углубления, может значительно искажать кривые нагрузки-смещения, что приводит к ошибочным значениям модуля на целых 30% [FLT: 1]].

Гидратация и хранение

Механические свойства кости очень чувствительны к гидратации. Обезвоженная кость может казаться более жесткой и твердой, чем гидратированная ткань. Для моделирования физиологических условий большинство протоколов требуют, чтобы образцы регидратировались в фосфат-буферном солевом растворе (PBS) в течение по крайней мере 24 часов до тестирования и оставались влажными во время углубления. Некоторые исследовательские группы используют конфигурацию жидких клеток, которая поддерживает тонкий слой жидкости на поверхности образца на протяжении всего эксперимента.

Методология наноидентификации

Тестирование проводится на полированной поперечной сечении биопсии кости, с углублениями, расположенными в областях, представляющих интерес, таких как корковая кость, трабекулярная кость или отдельные остеоны. Типичная последовательность теста включает в себя:

  1. Калибровка : Инструмент калибруется с использованием стандарта сравнения слитого кремнезема (известный модуль ~72 ГПа).
  2. Выбор места : Используя оптический микроскоп, оператор выбирает места вдали от кровеносных сосудов, лакун или явных трещин.
  3. Внутренность : Индентер прижимается к кости с постоянной скоростью деформации (например, 0,05 с-1) до максимальной глубины 500-1000 нм, удерживается в течение 10-30 секунд для оценки ползучести, затем выгружается.
  4. Анализ данных : Жесткость разгрузки установлена на модели Оливера-Фарра для извлечения уменьшенного модуля (Er) и твердости (H).

Измерение эластичного модуля и твердости

Упругий модуль, сообщаемый из наноиндентации, представляет собой модуль углубления (E]it), который связан с модулем Янга костной ткани. Для однородных изотропных материалов Eit = E/(1-ν2), где ν — отношение Пуассона. Для кости, являющейся анизотропной, модуль углубления соответствует примерно модулу в направлении, перпендикулярном плоскости углубления. Твердость (H) определяется как максимальная нагрузка, деленная на проецируемую зону контакта и отражает сопротивление ткани к постоянной деформации.

Типичные значения для кортикальной кости человека дают модуль углубления 15-25 ГПа и твердость 0,5-0,8 ГПа, хотя они варьируются в зависимости от возраста, заболевания и анатомического расположения.Трабекулярная кость, будучи более пористой, дает более низкие значения (модуль 5-12 ГПа).

Качество данных и воспроизводимость

Для учета неоднородности кости стандартно выполнять сетку углублений (например, 5×5 точек, разнесенных на 50 мкм) и сообщать среднее ± стандартное отклонение. Исключаются выбросы из-за пор или обломков. Использование статистически значимого числа углублений (не менее 25 на область) повышает надежность сравнений между группами (например, здоровые против остеопоротических).

Применение в исследованиях костей и клинической практике

Остеопороз и риск переломов

Остеопороз приводит к потере костной массы и ухудшению архитектуры, но он также влияет на внутреннее качество ткани. Исследования наноиндентации показали, что корковая кость у остеопоротических женщин имеет уменьшенный упругий модуль и повышенную твердость? Нет — твердость часто также уменьшается, но некоторые исследования сообщают о снижении модуля без пропорционального снижения твердости. Эта диссоциация предполагает, что изменения уровня ткани (например, снижение перекрестного связывания коллагена, измененный размер минерального кристалла) способствуют хрупкости независимо от МДД. Например, исследование биопсии бедренной шеи человека показало, что остеопоротическая кость имела модуль углубления ~18% ниже, чем возрастной здоровый контроль, даже после корректировки на МДД. Такие данные помогают уточнить модели риска переломов.

Для недавнего мета-анализа наноиндентации остеопоротической кости см. этот обзор в Bone .

Остеогенез несовершенный и генетические заболевания костей

В остеогенезе Ilpera мутации в генах коллагена I типа приводят к хрупкой кости. Наноидентификация биопсии костей у пациентов с ОИ выявляет парадоксальное увеличение жесткости на уровне ткани, но резкое снижение жесткости (энергия рассеивается до отказа). Этот «хрупкий» фенотип обусловлен измененными взаимодействиями минерала и коллагена. Метод оказался ценным для доклинического тестирования потенциальных методов лечения, таких как бисфосфонаты и ингибиторы склеростина, путем мониторинга изменений наномеханических свойств с течением времени.

Старение и дегенеративные изменения

С возрастом даже здоровая кость претерпевает изменения в своих механических свойствах. Кортикальная кость становится жестче, но хрупче, в то время как трабекулярная кость теряет как жесткость, так и прочность. Наноидентификация может количественно оценить эти изменения на уровне отдельных трабекул, показывая, что возрастная потеря прочности связана с увеличением перекрестных связей конечного продукта гликирования (AGE). Это знание открывает возможности для вмешательств, направленных на перекрестное сшивание коллагена.

Эффективность лекарственных средств и биомеханический мониторинг

Фармацевтические методы лечения остеопороза, такие как бисфосфонаты, деносумаб и аналоги паратиреоидных гормонов, обычно оцениваются по изменениям МПКТ и частоте переломов. Однако наноиндентация может обнаруживать ранние реакции на уровне ткани, которые предшествуют изменениям объемной плотности. Например, было показано, что лечение терипаратидом увеличивает модуль углубления трабекулярной кости в течение трех месяцев на животных моделях. Такая чувствительность делает наноиндентацию ценной вторичной конечной точкой в клинических испытаниях.

Проблемы и методологические подводные камни

Неоднородность и анизотропия

Кость представляет собой иерархический материал со значительной изменчивостью от одной микроструктурной особенности к другой. Модуль углубления остеона может отличаться на 20-30% в зависимости от того, сделан ли углубление вблизи гаверсовского канала или на цементной линии. Анизотропия дополнительно усложняет интерпретацию: углубления перпендикулярны ориентации коллагенового волокна дают разные модули, чем параллельные направлению волокна. Для смягчения этого исследователи должны тщательно документировать ориентацию биопсии и выполнять множественные углубления в выровненных областях.

Артефакты поверхностного приготовления

Несовершенная полировка может привести к повреждению подповерхностей (микротрещины, размазывание коллагеновых волокон), что изменяет механическую реакцию. Переполировка может вызвать облегчение между твердой и мягкой фазами, что приводит к ошибочной оценке зоны контакта. Было показано, что использование ионно-лучевого фрезерования (например, полировка широкого ионного пучка (BIB)) приводит к образованию превосходных поверхностей с минимальным повреждением для наноиндентации кости.

Стандартизация и межлабораторная изменчивость

В настоящее время не существует общепринятого протокола наноиндентации образцов биопсии костей. Изменения глубины углубления, скорости загрузки, состояния гидратации и методов анализа данных (например, выбор соотношения Пуассона) приводят к значительным различиям между лабораториями. Международная организация по стандартизации (ISO) выпустила общее руководство по инструментальной индентации (ISO 14577), но отсутствуют конкретные руководящие принципы для биологических тканей. Продолжаются усилия по созданию консенсусного протокола, при этом такие группы, как Американское общество исследований костей и минералов выступают за стандартизированную отчетность.

Будущие направления и новые технологии

В Vivo Nanoindentation

Традиционная наноиндентация требует экстрагированных биопсий, ограничивающих продольные исследования и клинический перевод. Новые устройства микроиндентации (например, OsteoProbe) позволяют in vivo измерять индекс прочности костного материала (BMSi) в коре голени. Хотя эта техника менее точна, чем лабораторная наноиндентация, эта техника показывает перспективность для оценки точки ухода и больших когортных исследований. Будущие усовершенствования направлены на то, чтобы принести истинную наноиндентацию в хирургические настройки с использованием минимально инвазивных устройств.

Мультимодальная интеграция

Сочетание наноиндентации с другими методами микроскопии и спектроскопии обеспечивает более полную картину качества костей.

Интеграция этих модальностей в один инструмент или совместно зарегистрированный рабочий процесс анализа является активной областью исследований. Отличный пример мультимодального анализа костей описан в исследовании Nature Scientific Reports, в котором сочетаются наноиндентация, микро-КТ и рамановская спектроскопия для выявления региона-специфического ослабления костей при остеоартрите.

Машинное обучение для интерпретации данных

Большие наборы данных, полученные из сетчатых отступов - часто тысячи кривых нагрузки - смещения - хорошо подходят для машинного обучения. Алгоритмы могут классифицировать костную ткань на здоровые, больные или обработанные категории на основе тонких моделей в ответе на перемещение силы. Нейронные сети были обучены прогнозировать возраст и состояние заболевания только из данных наноиндентации, достигая точности выше 85% в исследованиях, подтверждающих концепцию. Этот подход может когда-нибудь автоматизировать диагностический анализ биопсии костей.

Заключение

Наноидентификация стала незаменимым инструментом для биомеханической оценки образцов биопсии костей, предлагая количественные данные о жесткости тканей, твердости и зависящем от времени поведении в микромасштабе. Выявляя изменения, которые предшествуют или сопровождают потерю костной массы, она углубляет наше понимание остеопороза, генетических расстройств и хрупкости, связанной со старением. Продолжение методологических улучшений, особенно в контроле гидратации, подготовке поверхности и межлабораторной стандартизации, повысит ее клиническую значимость. Интеграция наноиндентации с дополнительными визуализациями и спектроскопическими методами, наряду с достижениями в анализе данных машинного обучения, указывает на будущее, где рутинное наномеханическое профилирование биопсий костей может направлять персонализированные методы лечения скелетных заболеваний.

По мере того, как область созревает, обещание перевода наноиндентации из исследовательской лаборатории в клинику становится все ближе — укрепляясь в эпоху, когда прочность кости оценивается не только по количеству костей, но и по качеству самого костного материала.