Биопечать островковых кластеров поджелудочной железы для лечения диабета

Понимание диабета и необходимость продвинутой терапии

Сахарный диабет является хроническим метаболическим расстройством, которое поражает более 530 миллионов взрослых во всем мире, число, по прогнозам, возрастет до 783 миллионов к 2045 году, согласно Международной диабетической федерации . Болезнь возникает из-за неспособности организма вырабатывать достаточное количество инсулина или эффективно использовать инсулин, что приводит к хронической гипергликемии. Диабет 1 типа (T1D) является результатом аутоиммунного разрушения бета-клеток поджелудочной железы, в то время как диабет 2 типа (T2D) включает прогрессирующую резистентность к инсулину и возможную дисфункцию бета-клеток. Традиционное управление зависит от экзогенного введения инсулина, пероральных гипогликемических агентов и модификаций образа жизни. Однако эти подходы не восстанавливают физиологическую регуляцию глюкозы в крови, оставляя пациентов в группе риска для осложнений, таких как нейропатия, нефропатия, ретинопатия и сердечно-сосудистые заболевания.

Трансплантация островков появилась в качестве клеточной заместительной терапии для отдельных пациентов с T1D. Протокол Эдмонтона, установленный в начале 2000-х годов, продемонстрировал, что трансплантация трупных островков в печень может достичь независимости от инсулина в течение нескольких лет. Тем не менее, широкое применение ограничено острой нехваткой донорских органов, необходимостью пожизненной иммуносупрессии и прогрессирующей недостаточностью трансплантата. Биопечать - метод аддитивного производства, который откладывает живые клетки и биоматериалы слой за слоем - предлагает преобразующий подход к созданию функциональных островковых кластеров поджелудочной железы ex vivo, потенциально преодолевая узкое место в снабжении и позволяя персонализированные, иммуномодулированные методы лечения.

Что такое биопечать?

Биопечать является подмножеством 3D биопроизводства , которое использует автоматизированное осаждение биоинки, нагруженной клетками, для создания тканевых конструкций с определенной архитектурой. В отличие от традиционной 3D-печати, в которой используются пластмассы или металлы, биопечать должна сохранять жизнеспособность клеток и способствовать функционированию тканей. Поле быстро развивалось с момента первого патента в 2003 году, с несколькими доступными способами биопечати:

Существенным для всех подходов к биопечати является биоинка — смесь живых клеток, гидрогелей (например, альгинат, желатинметакрилоил, коллаген, гиалуроновая кислота) и факторов роста или сигнальных молекул. Биоинка должна обеспечивать механическую поддержку, разрешать диффузию питательных веществ и позволять клеткам реконструироваться в функциональную ткань. Достижения в биоинке состав значительно повысил жизнеспособность и функциональность биопечатных островковых кластеров.

Биология островков поджелудочной железы и обоснование биопечати

Поджелудочная железа содержит около миллиона дискретных микроорганов, называемых островками Лангерганса, каждый диаметром 50-500 мкм. Островки состоят из пяти типов эндокринных клеток: инсулин-секретирующих бета-клеток (60-70% островковой массы), глюкагоносекретирующих альфа-клеток, соматостатин-секретирующих дельта-клеток, панкреатических полипептид-секретирующих PP-клеток и грелин-секретирующих эпсилон-клеток. Точное пространственное расположение - с бета-клетками в ядре и альфа-клетками в мантии - имеет решающее значение для паракринной сигнализации и скоординированного высвобождения гормонов. Например, глюкагон стимулирует секрецию инсулина в соседних бета-клетках, в то время как инсулин подавляет высвобождение глюкагона, поддерживая гомеостаз глюкозы.

Биопечать позволяет рекапитулировать эту нативную микроархитектуру. Размещая бета-клетки и поддерживающие клетки в определенных трехмерных моделях, исследователи могут создавать островковые кластеры, которые имитируют физиологическое соотношение и пространственную организацию природных островков. Было показано, что такие биопечатные островки выделяют инсулин в ответ на вызов глюкозы in vitro и нормализуют уровень глюкозы в крови у диабетических мышей в течение нескольких недель или месяцев. Кроме того, биопечать позволяет включать эндотелиальные клетки или проангиогенные факторы для содействия васкуляризации - критическое узкое место, которое ограничивает выживаемость трансплантированных островков из-за кислородной и питательной депривации до реваскуляризации.

Биопечать: шаг за шагом

1.Источник и подготовка клеток

Источник функциональных бета-клеток является одним из самых больших препятствий. Человеческие трупные островки остаются золотым стандартом, но их мало. Альтернативы включают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) дифференцированные в бета-подобные клетки, эмбриональные стволовые клетки (ESC)-производные панкреатические предшественники и ксеногенные источники, такие как островки свиней. Достижения в протоколах дифференциации теперь дают инсулин-позитивные клетки с глюкозо-реактивной секрецией, которая приближается к первичным бета-клеткам человека. Например, VX-880 Vertex Pharmaceuticals, исследуемая терапия стволовыми клетками, недавно восстановленная эндогенная выработка инсулина у пациента T1D. В сочетании с биопечатью клетки, полученные из iPSC, могут быть расширены на неопределенный срок, обеспечивая практически неограниченный запас для изготовления.

2.Формулирование биоинков

Идеальный биоинкер для биопечати островков поджелудочной железы должен обладать несколькими свойствами:

  • Утоляющее стрижку поведение для защиты клеток во время экструзии.
  • Быстрое сшивание для поддержания точности формы после печати.
  • Биокомпаратность для поддержки долгосрочной жизнеспособности и функционирования.
  • Прозрачность , позволяющая обмениваться кислородом, питательными веществами и отходами.
  • Кастомизируемая деградация для соответствия ремоделированию тканей.

Общие компоненты биоинки для островковой биопечати включают природные полимеры, такие как альгинат (производный от морских водорослей), который образует стабильный гель в присутствии ионов кальция; желатиновый метакрилоил (GelMA), фотосшиваемое производное желатина; и децеллюляризованный внеклеточный матрикс поджелудочной железы (ECM), который сохраняет тканеспецифические биохимические сигналы. Композитные гидрогели - смешивание альгинат с GelMA или с компонентами ECM - часто превосходят однокомпонентные биоинки. Исследование 2022 года, опубликованное в Advanced Healthcare Materials , показало, что бета-клетки человека, полученные из iPSC, сохраняли >85% жизнеспособности в течение 28 дней in vitro и высвобождали с-пептид глюкозозависимой манерой .

3. Печать и сшивание

После загрузки биоинки в стерильный картридж оптимизируются параметры принтера: диаметр сопла (обычно 100-500 мкм), скорость печати (5-30 мм/с), давление (10-100 кПа) и высота слоя (50-200 мкм). Островные кластеры печатаются как небольшие цилиндры или сферы (диаметр 200-500 мкм) для имитации естественного размера островка и обеспечения адекватной диффузии кислорода. Проводится одновременное или последовательное сшивание - ионное гелеобразование для альгината, фотосшивание для GelMA - для стабилизации конструкции. Для включения васкуляризации можно печатать второй биоинкер, содержащий эндотелиальные клетки пуповины человека, HUVECs. Недавний инновационный подход использует микрожидкостное биопечать для генерации однородных монодисперсных островковых кластеров с высокой пропускной способностью (более 10 000 кластеров в час).

4. созревание и функциональное тестирование

После печати конструкции культивируются в биореакторе или стандартном инкубаторе с средами, дополненными факторами роста, такими как никотинамид, эксендин-4 или фактор роста гепатоцитов, для содействия созреванию бета-клеток. Функциональная оценка включает:

  • Статическая секреция инсулина, стимулируемая глюкозой (GSIS) — измерение высвобождения инсулина после последовательной инкубации с низкой (2,8 мМ) и высокой (16,7 мМ) глюкозой.
  • Анализы перифузии — динамическое измерение кинетики секреции инсулина.
  • Иммунофлуоресценция — окрашивание для инсулина, с-пептида, глюкагона и Ki67 (маркер пролиферации).
  • Трансплантация диабетическим грызунам — мониторинг уровня глюкозы в крови, массы тела и тестов на толерантность к глюкозе в течение нескольких недель.

Преимущества биопечатных островковых кластеров для лечения диабета

Потенциал биопечатных островковых конструкций выходит за рамки простой замены клеток:

  • Неограниченное, стандартизированное предложение — Используя iPSC или ESC, миллионы функциональных островковых кластеров могут быть произведены в условиях надлежащей производственной практики (GMP), устраняя дефицит доноров.
  • Точный контроль дозы — Количество и размер кластеров могут быть адаптированы к метаболическим потребностям пациента, что позволяет действительно персонализировать клеточную терапию.
  • Усовершенствованная функция — Трехмерная архитектура улучшает чувствительность к глюкозе по сравнению с двумерной культурой или простыми клеточными агрегатами. Биопечатные кластеры часто демонстрируют более зрелый фенотип с более высоким содержанием инсулина и улучшенной секреторной кинетикой.
  • Иммунная защита посредством инкапсуляции — Биоинки могут включать иммуноизоляционные материалы (например, альгинат с высоким содержанием гулюроновой кислоты или слои поли-L-орнитина / полиэтиенимина), которые блокируют иммунные клетки и антитела, позволяя глюкозе, инсулину и питательным веществам проходить. Это может уменьшить или устранить необходимость системной иммуносупрессии.
  • Интеграция вспомогательных клеток — совместное печатание с мезенхимальными стромальными клетками (МКС) или регуляторными Т-клетками (Tregs) может создать местную иммуномодулированную микросреду, которая ослабляет иммунный отторжение и способствует выживанию трансплантата.
  • Масштабируемое производство — Автоматизированные платформы биопечати могут производить тысячи островковых кластеров на партию с постоянным качеством и прослеживаемостью.

Современные вызовы и ограничения

Несмотря на значительный прогресс, необходимо устранить несколько препятствий, прежде чем биопечатные островковые кластеры начнут регулярное клиническое использование:

1. Кислород и питательные вещества

Конструкции диаметром более ~200 мкм страдают от гипоксического ядра из-за отсутствия сосудистой сети. На сегодняшний день большинство биопечатных островков, имплантированных подкожно или внутрибрюшинно, полагаются на диффузию из окружающих тканей, что является недостаточным. Стратегии, которые исследуются, включают:

  • Преваскуляризация — печать эндотелиальных клеток в прилежащей сети, которая может анастомозировать сосудами-хозяевами.
  • Включение биоматериалов, генерирующих кислород — таких как пероксид кальция или фторуглероды, которые выделяют кислород в течение нескольких дней.
  • Кокультура с поддерживающими клетками — фибробластами или МСК, которые выделяют проангиогенные факторы, такие как VEGF.
  • Альтернативные места трансплантации — оментум, передняя камера глаза или подкожные устройства с предваскуляризированными камерами (например, Encaptra устройство от ViaCyte).

2. Иммунное отторжение

Аллогенные островки (даже из iPSC) будут распознаваться и разрушаться иммунной системой реципиента, если они не защищены. Покрытия для иммуноизоляции должны быть безотбойными, биосовместимыми и долговечными. Кроме того, инкапсуляция может ухудшить диффузию кислорода и вызвать реакцию инородного тела с фиброзом, который блокирует обмен питательных веществ. Достижения в проектировании поверхности клеток , такие как присоединение полиэтиленгликоля (PEG) или отображение противовоспалительных молекул, объединяются с биопечатью для создания «стелс» островков, которые уклоняются от иммунного обнаружения.

3.Долгосрочное выживание и функционирование

Немногие исследования следовали за биопечатными островковыми трансплантатами более трех месяцев на животных моделях. Долговечность остается проблемой. Может произойти дедифференциация островков, потеря чувствительности к глюкозе и осаждение амилоида (обычно при диабете 2 типа). Постоянный мониторинг и редактирование защитных генов (например, чрезмерная экспрессия антиапоптотических генов или недостаточная экспрессия датчиков стресса) могут продлить срок жизни трансплантата.

4.Регулятивные и производственные проблемы

Продукты из биопечатных клеток классифицируются FDA и EMA как продукты комбинирования , требующие руководящих принципов как для устройства (принтера), так и для биологического агента (клеток). Стандартизация состава биоинков, стерильности, критериев высвобождения и изменчивости от лота к лоту все еще находится в стадии разработки. Кроме того, стоимость генерации, дифференциации и биопечати GMP-класса остается высокой, хотя ожидается, что экономия от масштаба снизит затраты по мере улучшения автоматизации.

Недавние прорывы в исследованиях и клинические испытания

Большая часть фундаментальной работы в биопечатных островковых конструкциях была выполнена академическими лабораториями, такими как в Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, University of Toronto и University of Florida. В 2021 году исследователи из Гарварда и Массачусетского технологического института напечатали модель «живого островка», которая включала бета-клетки, альфа-клетки и эндотелиальные клетки в децеллюляризированном биоинке ECM поджелудочной железы. Конструкции восстанавливали нормогликемию у мышей, вызванных стрептозотоцином, в течение более 10 недель [[Nature Nanotechnology].

Игроки отрасли также вкладывают значительные средства. Cellink (теперь часть BICO) разработала специализированный протокол биоинкарнации поджелудочной железы и биопечати для исследований островков. Organovo исследует экзокринную ткань поджелудочной железы, но еще не коммерциализировала островковые продукты.Sernova Corp объединяет клеточный мешок (биопечатный каркас) с инкапсулированными островками и инициировала клиническое испытание фазы I/II в Канаде для T1D. Хотя мешок еще не полностью биопечатан, он представляет собой первое клиническое применение островковой терапии на основе каркаса .

Параллельно биоинженеры интегрируют датчики непрерывного мониторинга глюкозы (CGM) непосредственно в биопечатные конструкции для управления замкнутым контуром — концепция, получившая название «бионические островки». Такие интеллектуальные конструкции могут выпускать инсулин в ответ на показания глюкозы в реальном времени без внешнего насоса. Ранние прототипы были продемонстрированы in vitro, с временем отклика менее пяти минут.

Оригинальное название: From Bench to Bedside

Дорожная карта клинического перевода биопечатных островковых кластеров поджелудочной железы включает в себя несколько этапов:

  • Демонстрация долгосрочной (> 1 года) безопасности и эффективности у приматов, не являющихся людьми.
  • Разработка полностью автоматизированной, совместимой с GMP платформы для биопечати островковых кластеров.
  • Проверка стратегий иммуноизоляции, которые позволяют 6-12 месяцев независимости инсулина без иммуносупрессии.
  • Фаза I/II испытаний, включающая небольшую группу пациентов с хрупким Т1D.

Учитывая траекторию связанных клеточных терапий, таких как продукт ViaCyte PEC-Direct, который показал прививку и экспрессию инсулина у пациентов, вполне вероятно, что биопечатные островки будут проходить тестирование на людях в течение следующих 5-7 лет. Первые применения, вероятно, будут у пациентов с тяжелой гипогликемией, для которых соотношение риска и пользы наиболее благоприятно. По мере улучшения производственных масштабов и иммунозащиты биопечатные островковые кластеры могут в конечном итоге заменить ежедневные инъекции инсулина для миллионов людей с T1D и, возможно, помочь восстановить функциональную массу бета-клеток в T2D.

В конечном счете, конвергенция биологии стволовых клеток, биоинженерии и 3D-печати готова обеспечить сдвиг парадигмы в лечении диабета — преобразование его из болезни пожизненного управления в болезнь длительного клеточного восстановления. В то время как проблемы остаются, темпы инноваций свидетельствуют о том, что биопечатное лечение диабета больше не является вопросом , если , но , когда .