Биопечать сосудистых дольков печени для трансплантации

Хронические заболевания печени затрагивают миллионы людей во всем мире, и когда пациент прогрессирует до конечной стадии печеночной недостаточности, единственным окончательным лечением является трансплантация органов. Тем не менее, спрос на донорскую печень намного превышает предложение, при этом тысячи пациентов умирают в списках ожидания каждый год. В ответ исследователи обращаются к регенеративной медицине и биопечати для изготовления функциональной ткани печени, которая может в один прекрасный день преодолеть разрыв. Среди наиболее многообещающих достижений - биопечать васкуляризированных долей печени - крошечные, повторяющиеся функциональные единицы печени, которые содержат сложную сеть кровеносных сосудов, необходимых для поддержания жизни. В этой статье исследуется наука, стоящая за этой технологией, препятствия, которые остаются, и потенциал, который она имеет для преобразования трансплантологии.

Критическая потребность в сосудовидных тканях печени

Заболевания печени, в том числе цирроз, вирусный гепатит, неалкогольная жировая болезнь печени и гепатоцеллюлярная карцинома, являются одними из главных причин смерти во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения, заболевания печени ежегодно вызывают более двух миллионов смертей. Для пациентов с острой или хронической печеночной недостаточностью трансплантация печени является золотым стандартом, но количество доступных донорских органов плато, в то время как спрос продолжает расти. Только в США более 10 000 человек находятся в списке ожидания трансплантации печени, и многие не выживут достаточно долго, чтобы получить одну.

Частичное пересадка печени от живых доноров может помочь, но она несет риски для донора и не всегда осуществима. Жизнеспособной альтернативой будет создание функциональной ткани печени, которая может быть имплантирована непосредственно пациенту, восстанавливая функцию без необходимости в целом органе. Однако для того, чтобы сконструированная ткань печени выжила после имплантации, она должна иметь встроенную сосудистую сеть — кровеносные сосуды, которые соединяются с кровообращением пациента и доставляют кислород и питательные вещества во встроенные клетки. Без такой васкуляризации ядро ткани умрет от гипоксии в течение нескольких часов. Именно здесь биопечать предлагает преобразующее преимущество: способность строить слой за слоем ткани, включая сосудистые каналы именно там, где они необходимы.

Понимание биопечати дольков печени

Биопечать — это метод аддитивного производства, который откладывает живые клетки, факторы роста и биоматериалы в точных трехмерных моделях для воссоздания нативной тканевой архитектуры. Для дольков печени — гексагонально сформированных функциональных единиц печени, которые обычно измеряют от одного до двух миллиметров в диаметре — биопечать направлена на репликацию сложного расположения гепатоцитов, желчных каналов и синусоидальной сети кровеносных сосудов. Конечной целью является создание дольки, которая может выполнять детоксикацию, синтез белка и регуляцию метаболизма, как естественная.

Биологическая архитектура лепестковой лобули

Чтобы оценить проблему, рассмотрим естественную микроструктуру печени. Одна долька организована вокруг центральной вены, с пластинами гепатоцитов, излучающимися наружу, как спицы на колесе. Между этими клеточными пластинами находятся синусоиды — капиллярные каналы, выстланные эндотелиальными клетками и клетками Купфера, которые переносят кровь из портального тракта на периферии к центральной вене. Биле секретируется в противоположном направлении. Это поляризованное расположение гарантирует, что каждый гепатоцит находится в нескольких длинах клеток кровоснабжения, что позволяет эффективно обмениваться газами и метаболитами. Воспроизведение этой трехмерной полярности и высокой плотности клеток является одной из самых главных проблем в тканевой инженерии, и биопечать однозначно подходит для решения этой проблемы.

Ключевые компоненты биопечатных дольков печени

Биопечать васкуляризированной дольки требует тщательного отбора типов клеток, биоматериалов и методов печати. Основные строительные блоки включают следующее:

• Гепатоциты: Первичные паренхиматозные клетки печени, отвечающие за метаболические функции, включая детоксикацию, синтез белка и выработку желчи. Первичные гепатоциты человека являются золотым стандартом, но их трудно расширить в культуре; индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC)-производные гепатоциты являются многообещающей альтернативой.
• Эндотелиальные клетки: Клетки, выстилающие внутреннюю часть кровеносных сосудов. Для синусоидальных клеток печени синусоидальные эндотелиальные клетки (LSEC) идеальны, поскольку образуют фенестратные капилляры, позволяющие избирательно проходить молекулы. Человеческие эндотелиальные клетки пуповинной вены (HUVEC) часто используются в качестве замены в ранних стадиях исследований.
• Внеклеточный матрикс (ECM) биоинкер: Гидрогель, имитирующий естественный ECM печени, обеспечивающий структурную поддержку и биохимические сигналы. Общие биоинки включают коллаген типа I, желатиновый метакрилоил (GelMA), альгинат, гиалуроновую кислоту и децеллюляризованную ECM печени. Биоинкер должен поддерживать жизнеспособность клеток во время печати и обеспечивать правильную жесткость и разлагаемость для созревания тканей.
• Поддерживающие клетки: Клетки печени и клетки Купфера могут быть включены для лучшей эмуляции микроокружения печени и иммунных функций, хотя многие современные конструкции сосредоточены на спаривании гепатоцитов и эндотелий.
• Сосудистые каналы: В процессе печати в паттерне желаемых кровеносных сосудов может быть нанесен жертвенный биоинкер (например, желатиновый или плуронический F127) и впоследствии удален путем мягкого нагрева или растворения, оставляя после себя полый просвет, который можно засеять эндотелиальными клетками для создания сети патентных сосудов.

Методы печати: от экструзии до световых методов

Несколько стратегий биопечати используются для изготовления дольков печени:

• Экструзионное биопечать: Пневматическая или механическая система проталкивает нагруженный клетками гидрогель через сопло в контролируемом рисунке. Этот метод может производить большие конструкции, но может подвергать клетки сдвигу напряжения. Он хорошо подходит для создания более крупных каналов, необходимых для васкуляризации.
• Биопечать по требованию: Использует тепловые или пьезоэлектрические импульсы для выброса небольших капель биоинки. Она обеспечивает высокое разрешение, но имеет более низкую плотность клеток и больше подходит для моделирования факторов роста или тонкого слоя клеток.
• Световая биопечать (DLP и SLA): Цифровая обработка света (DLP) и стереолитография (SLA) используют сфокусированный свет для фотополимеризации слоя биочернил послойно. Эти методы обеспечивают исключительное разрешение (до микрометров) и идеально подходят для захвата мелких деталей, таких как желчные канальцы. Однако они обычно требуют специализированных фотосшиваемых биочернил и могут быть медленнее для крупных конструкций.
• Коаксиальная экструзия: Система с двумя соплами, которая одновременно печатает ядро и оболочку, полезна для создания канала (полого ядра), встроенного в оболочку гидрогеля с клеточной нагрузкой.

Сочетание этих методов, например, использование DLP для формирования гепатоцитных пластин и экструзии для формирования более крупной центральной вены, позволяет исследователям построить иерархически организованную дольку с необходимым разрешением и масштабом. Обзор 2019 года в Nature Reviews Materials подчеркивает, как многотехническая интеграция подталкивает поле к анатомически точным конструкциям печени.

Решение проблемы со сквозной сосудистой системой

Васкуларизация является единственным самым большим препятствием для создания трансплантируемой ткани печени. Без перфузионного кровоснабжения любая ткань толщиной более 200 микрометров будет страдать от кислородной и питательной депривации в своей основе. В дольках печени естественная синусоидальная сеть гарантирует, что каждый гепатоцит находится в пределах нескольких ширин клеток крови. Биопечать может имитировать эту архитектуру, но имплантация предварительно сформированной сосудистой сети, которая будет анастомозировать с циркуляцией хозяина в течение нескольких дней, остается серьезной проблемой.

Стратегии построения сосудистой сети

Исследователи разработали несколько подходов к созданию васкуляризированных дольков:

• Жертвоприношения: Каналообразующий материал (например, желатин или водорастворимый воск) печатается в желаемой геометрии сосуда и затем удаляется, оставляя полую трубку. Каналы впоследствии эндотелиализируются путем посева с эндотелиальными клетками. Этот метод хорошо работает для сосудов большого диаметра (например, центральной вены или портальной вены), но становится более сложным в капиллярном масштабе.
• Включение сосудов: В качестве каркаса, на который сеяны гепатоциты, используется предварительно сформированная микрососудистая сеть, такая как децеллюляризированный органный каркас или микрожидкостный чип. Существующая структура сосуда может быть затем повторно эндотелиализована. Этот подход жертвует некоторой гибкостью конструкции, но использует естественные сосудистые модели.
• На месте васкуляризации: Конструкция имплантируется и опирается на ангиогенный ответ хозяина на выращивание новых сосудов в ткани. Факторы роста, такие как VEGF, могут быть включены в биоинкер для привлечения эндотелиальных проростков. Однако этот процесс может занять дни или недели, и ядро толстой конструкции может стать некротическим до вторжения сосудов.
• Соосная печать: Как уже упоминалось, сопло внутри сопла позволяет одновременно осаждать безклеточное ядро (стать сосудом) и нагруженную ячейкой внешнюю оболочку. Этот метод быстро набирает популярность для печати трубчатых структур.

Знаковое исследование, опубликованное в журнале Science Advances , продемонстрировало биопечать ткани печени сантиметрового масштаба, содержащей патентную сосудистую сеть, которая может быть пронизана кровью [ссылка на бумагу] . После трансплантации мышам сосуды, связанные с циркуляцией хозяина в течение одной недели, и гепатоциты сохраняли функциональность в течение нескольких недель.