Биореакторная оптимизация дизайна для созревания сосудистой ткани

Центральная роль биореакторов в развитии сосудистого графта

Вазкулярная тканевая инженерия стремится производить жизнеспособные, механически надежные заменители кровеносных сосудов для таких применений, как шунтирование коронарной артерии, восстановление периферических сосудов и артериовенозный доступ для гемодиализа. В то время как конструкция каркаса и клеточный источник получают значительное внимание, среда биореактора, в которой эти конструкции созревают, определяет, соответствует ли конечный трансплантат строгим требованиям для клинической имплантации. Биореактор - это гораздо больше, чем контейнерный сосуд; это динамическая платформа, которая контролирует физические и химические сигналы, направляющие сборку ткани. Оптимизация конструкции биореактора непосредственно влияет на выравнивание клеток, осаждение внеклеточного матрикса (ECM), механическую прочность и эндотелиальную барьерную функцию. Без преднамеренной оптимизации конструкции даже самая многообещающая комбинация каркаса-клетки не сможет произвести функциональную сосудистую замену.

Сложность созревания сосудистой ткани требует, чтобы биореакторы воссоздавали ключевые аспекты нативной гемодинамической среды. Кровеносные сосуды in vivo испытывают пульсативное давление, циклическое окружное растяжение и напряжение сдвига света от проточной крови. Эти механические силы регулируют фенотип эндотелиальных клеток, сократимость гладкомышечных клеток и организацию коллагеновых и эластинных волокон. Биореакторы должны воспроизводить эти стимулы контролируемым, воспроизводимым образом, сохраняя стерильность, питание питательными веществами и удаление отходов. Проблема заключается в том, что каждый параметр - скорость потока, форма волны давления, напряжение кислорода и средний состав - взаимодействует с другими, делая оптимизацию многомерной проблемой.

Исследователи разработали ряд конструкций биореакторов, от простых колб статической культуры до сложных перфузионных систем с активным контролем обратной связи. Эволюция этих систем отражает растущее понимание механобиологии сосудистого развития. Ранние статические культуры производили тонкие, механически слабые ткани, потому что только диффузионный транспорт не может поддерживать метаболические потребности толстой конструкции. Введение потока не только улучшило транспортировку массы. Введение сдвига не только улучшило транспортировку массы, но и обеспечило сдвиговое напряжение, которое регулируло эндотелиальную оксидную синтазу и выровненные эндотелиальные клетки в направлении потока. Следующее поколение биореакторов добавило циклическое растяжение, чтобы имитировать пульсовое давление сердечного цикла, которое стимулировало гладкомышечные клетки организовывать окружно и откладывать выровненные ECM. Сегодняшние оптимизированные конструкции интегрируют несколько стимулов одновременно, часто с датчиками в реальном времени и адаптивными алгоритмами управления.

Цель данной статьи – изучить ключевые факторы, способствующие оптимизации биореакторов для созревания сосудистой ткани, обсудить инновационные инженерные решения, появившиеся в последние годы, и выявить оставшиеся препятствия, которые необходимо преодолеть для перевода этих технологий с лабораторного стенда в хирургический набор. Обсуждение будет сосредоточено на динамике потока, механической нагрузке, доставке кислорода и питательных веществ, выборе материала и интеграции систем мониторинга и автоматизации.

Критические параметры для оптимизации биореакторов

Каждая система биореакторов должна уравновешивать конкурирующие требования: обеспечивать достаточную механическую стимуляцию для содействия созреванию, избегая при этом повреждения развивающейся ткани; эффективно доставлять кислород и питательные вещества при сохранении однородной динамической среды жидкости; и обеспечивать стерильность, позволяя при этом повторять отбор проб и корректировку. В следующих подразделах подробно описаны параметры, которые требуют тщательной оптимизации.

Динамика потока и стресс сдвига

Режим потока внутри сосудистого биореактора напрямую влияет на выживаемость эндотелиальных клеток, выравнивание и барьерную функцию. Ламинарный поток с контролируемым напряжением сдвига в физиологическом диапазоне (10-20 дина/см2 для артериального эндотелия) способствует спокойному, атеропротекторному фенотипу эндотелия. Турбулентный поток или чрезмерно высокий стресс сдвига может вызвать отслоение клеток, апоптоз или фенотипическую модуляцию. И наоборот, низкий стресс сдвига (<4 дина/см2) приводит к дисфункции эндотелия, повышенной проницаемости и провоспалительному состоянию.

Оптимизация динамики потока требует внимания к геометрии входа и выхода, использованию распределителей потока или диффузоров и устранению зон застоя, где могут накапливаться отходы. Моделирование динамики сдвига жидкости (CFD) стало важным инструментом для прогнозирования распределения напряжения сдвига внутри просвета конструкции и через его стенку. Многие недавние проекты включают пористые каркасы, которые позволяют осуществлять трансмуральный поток (протекать через стенку), что улучшает транспорт питательных веществ к медиальному слою и обеспечивает дополнительные механические сигналы для гладких мышечных клеток. Однако трансмуральный поток должен быть тщательно сбалансирован, чтобы избежать чрезмерного падения давления или неравномерной перфузии.

Пульсатильный поток с частотой, соответствующей участку целевого сосуда (обычно 1-2 Гц для артериального применения), дополнительно усиливает эндотелиальную функцию и организацию ECM. Форма формы волны - систолический восходящий удар, диастолический распад и амплитуда импульсного давления - может быть настроена на репликацию либо артериального, либо венозного состояния. Некоторые продвинутые биореакторы используют программируемые насосы, которые могут изменять скорость потока и частоту импульса в течение периода культуры, постепенно увеличивая механическую стимуляцию по мере того, как конструкция набирает силу.

Циклическая механическая растяжка

Сосудистые клетки гладкой мускулатуры в медиальном слое подвергаются циклическому обхвату в течение каждого сердечного цикла. Эта механическая нагрузка запускает внутриклеточные сигнальные пути, которые регулируют пролиферацию клеток, выравнивание и синтез ECM. В биореакторах циклическое растяжение обычно применяется путем надувания податливого внутреннего манделя или путем давления на просвет конструкции. Магнитуда растяжения (часто выражаемая в виде процентного напряжения) должна находиться в физиологическом диапазоне 5-15% для артерий, хотя более высокие штаммы могут временно использоваться для ускорения отложения ECM.

Оптимизация параметров растяжения включает частоту, амплитуду, рабочий цикл и продолжительность в день. Исследования показали, что непрерывное растяжение менее эффективно, чем прерывистое растяжение, с периодами отдыха, позволяющими ремоделировать ECM и предотвращать истощение клеток. Направление растяжения также имеет значение: одноосное растяжение способствует выравниванию перпендикулярно оси деформации, в то время как двуосная или многоосная нагрузка более тесно имитирует среду in vivo и производит более организованную ткань. Некоторые инновационные конструкции используют пневматические или электромагнитные приводы для нанесения растяжения при одновременном измерении механических свойств конструкции в режиме реального времени, что позволяет контролировать обратную связь для поддержания постоянной амплитуды деформации независимо от жесткости ткани.

Кислород и доставка питательных веществ

Инженерные сосудистые ткани, особенно имеющие клинически значимую толщину (>1 мм), страдают от диффузионно-ограниченного переноса кислорода. Без активной перфузии концентрация кислорода падает до гипоксических уровней в пределах нескольких сотен микрометров поверхности. Гипоксия вызывает гибель клеток, фиброз или аберрантный состав ECM. Поэтому биореакторы должны доставлять кислород не только на люминную поверхность, но и по всей толщине стенки. Это достигается за счет люминесцентной перфузии в сочетании с трансмуральным потоком или путем встраивания кислородсгенерирующих материалов в каркас.

Оптимизация доставки кислорода предполагает балансирование кислородного напряжения в среде со скоростью потребления клеток. Гипероксия (слишком высокий уровень кислорода) может генерировать реактивные формы кислорода и повреждать клетки, в то время как гипоксия ухудшает метаболизм. Типичные целевые значения варьируются от 40 до 120 мм рт.ст. для парциального давления кислорода в среде вблизи клеток. Кислородные носители, такие как перфторуглеродные эмульсии или носители кислорода на основе гемоглобина, могут быть добавлены для увеличения пропускной способности кислорода без необходимости высоких скоростей потока, которые вызвали бы чрезмерный сдвигающий стресс. Альтернативно, некоторые биореакторы включают мембранный оксигенатор, подобный тем, которые используются в сердечно-легочных обходных схемах.

Доставка питательных веществ, особенно глюкозы и аминокислот, тесно связана с скоростью потока и частотой обмена среды. Непрерывная перфузия со свежей средой превосходит пакетное кормление, поскольку она поддерживает стабильные концентрации метаболитов и удаляет ингибирующие отходы, такие как лактат и аммиак. Состав среды также может быть скорректирован с течением времени, чтобы отразить изменяющиеся метаболические потребности созревающей ткани. Например, во время ранней пролиферативной фазы более высокие концентрации глюкозы и сыворотки поддерживают расширение клеток, в то время как во время фазы созревания более низкие уровни сыворотки и более высокие уровни аскорбата способствуют синтезу ECM.

Выбор материала для компонентов биореактора

Материалы, используемые для создания биореакторной камеры, трубок, соединителей и датчиков, должны быть биосовместимыми, нецитотоксичными и способными выдерживать повторяющиеся циклы стерилизации (аутоклавирование, оксид этилена или гамма-облучение). Полисульфон, поликарбонат и силикон медицинского класса являются общим выбором для жестких компонентов, в то время как термопластичные эластомеры используются для гибких мембран, которые передают циклическое растяжение. Внутренние поверхности, которые контактируют с культуральной средой, должны быть гладкими и не адсорбционными, чтобы минимизировать загрязнение белка и микробную адгезию.

Для самого каркаса материалы варьируются от натуральных полимеров (коллаген, фибрин, децеллюляризованный ECM) до синтетических биоразлагаемых полимеров (полигликолевая кислота, поликапролактон, полиуретан). Интерфейс между каркасом и биореактором должен быть свободным от утечки под давлением. Многие конструкции используют O-кольца или прокладки на заказ. Прозрачные материалы, такие как поликарбонат или стекло, позволяют визуально проверять конструкцию во время культивирования, в то время как непрозрачные материалы могут потребоваться для УФ-чувствительных компонентов. Недавние усилия по снижению стоимости и улучшению одноразовости привели к использованию 3D-печатных биореакторов, изготовленных из поли(молочная кислота) или других печатных биосовместимых полимеров.

Модификация поверхности гепарином или другими биологически активными покрытиями может снизить тромбогенность, если схема биореактора включает кровь или плазму. Однако для большинства применений in vitro простых необрабатывающих покрытий, таких как полиэтиленгликоль, достаточно для предотвращения неспецифической адсорбции белка и поддержания чистой окружающей среды.

Расширенные конфигурации биореакторов для созревания сосудистой ткани

В первом поколении сосудистых биореакторов использовалась простая конструкция трубки в оболочке, где каркас был канюляционным на обоих концах и подключен к перистальтическому насосу. Хотя эти системы были эффективны для демонстрации базовой осуществимости, они не обладали способностью применять контролируемую механическую нагрузку или неинвазивно контролировать развитие тканей. За последнее десятилетие появилось множество передовых конфигураций, каждая из которых предназначена для устранения конкретных ограничений.

Двухкомпонентные перфузионные системы

Эти биореакторы разделяют пути светового и аблюминального потока, позволяя независимо контролировать нагрузку сдвига на эндотелий и подачу питательных веществ в медиальный и адвентициальный слои. В типичной конструкции конструкция подвешена между двумя камерами: внутренняя камера переносит поток через просвет, в то время как внешняя камера купает внешнюю поверхность. Такое расположение позволяет использовать различные составы среды для популяций эндотелиальных и гладкомышечных клеток, имитируя компартментализацию in vivo. Некоторые системы с двумя отделами добавляют третью, пористую мембрану для поддержки кокультуры без смешивания клеток.

Оптимизация таких систем направлена на балансировку скорости потока между отсеками, чтобы избежать градиентов давления, которые могут разрушать или растягивать стенку сосуда. Разность давления в переходной среде может быть установлена на желаемое значение (например, 80-120 мм рт.ст. для артериального кондиционирования) путем регулирования относительных высот впускных и выпускных резервуаров или с помощью независимых насосов с датчиками давления. Конструкции с двойным отсеком также облегчают введение циркулирующих иммунных клеток или наночастиц для изучения взаимодействий клеток и материалов в динамических условиях.

Многоконструкционные и высокопроизводительные биореакторы

По мере продвижения поля к клиническому переводу способность производить несколько сосудистых трансплантатов одновременно становится критической. Высокопроизводительные биореакторы решетки нескольких конструкций параллельно, каждая с независимым или общим контролем потока. Эти системы уменьшают изменчивость, подвергая все конструкции одним и тем же условиям окружающей среды, позволяя прямое сравнение различных каркасов, источников клеток или протоколов культуры. Многоконструкционные конструкции должны решать проблему поддержания равномерного распределения потока по всем каналам; часто многообразие с ограничителями потока используется для выравнивания сопротивления.

В исследовательских условиях миниатюрные биореакторы (также называемые системами «орган на чипе») были разработаны для скрининга лекарств и механистических исследований. Эти микрофлюидные устройства используют мягкую литографию для создания каналов с размерами, похожими на мелкие артерии. Хотя они не предназначены для производства имплантируемых трансплантатов, они позволяют точно контролировать градиенты потока, растяжения и кислорода в формате, совместимом с высококонтенсивной визуализацией. Прозрения этих микромасштабных систем могут информировать о дизайне более крупных биореакторов для производства тканей.

Биореактор с интегрированным механическим тестированием

Традиционно механические свойства спроектированного судна оценивались только в конце культуры, требующей деструктивного тестирования. Новые конструкции биореакторов включают датчики и исполнительные механизмы, которые позволяют неразрушающую механическую оценку во время созревания. Например, датчик давления может записывать давление просвета, в то время как камера отслеживает изменения диаметра, позволяя вычислять соответствие, давление разрыва и вязкоупругие параметры. Эти измерения могут использоваться для регулировки условий культуры в реальном времени - если конструкция слишком совместима, амплитуда циклического растяжения может быть увеличена для стимулирования дальнейшего осаждения ECM.

Некоторые системы используют ультразвуковую или оптическую когерентную томографию (OCT) для изображения толщины стенки сосуда, диаметра просвета и организации ECM в несколько временных точек. Интеграция этих методов визуализации в биореактор остается технически сложной из-за артефактов движения и необходимости стерильных интерфейсов, но прототипы продемонстрировали осуществимость. Конечной целью является «умный биореактор», который может автономно оптимизировать условия на основе непрерывной обратной связи, уменьшая необходимость ручного вмешательства и улучшая воспроизводимость.

Мониторинг в реальном времени и контроль обратной связи

Оптимизация условий биореактора возможна только в том случае, если ключевые параметры можно измерить без нарушения культуры. Традиционный автономный отбор проб (например, вывод среды для анализа глюкозы и лактата) обеспечивает только моментальный снимок и может вводить риск загрязнения. Технологии мониторинга в режиме реального времени быстро развиваются и интегрируются в сосудистые биореакторы для обеспечения контроля замкнутого цикла.

Оптические датчики, встроенные в биореакторную камеру, могут измерять рН, растворенный кислород и температуру через прозрачные окна без прямого контакта со средой. Волоконно-оптические датчики кислорода, например, основаны на флуоресцентном гашении и могут выдерживать многократную стерилизацию. Электрохимические датчики глюкозы и лактата могут быть размещены в потоке, а их выход можно использовать для регулировки среднего расхода или состава. Дополнительно резистивные тензодатчики или емкостные датчики давления, установленные на стенке биореактора, обеспечивают непрерывные данные о механической нагрузке.

Алгоритмы управления обратной связью варьируются от простых пропорциональных-интегральных-производных (PID) контроллеров, которые поддерживают заданную точку, до более продвинутых модельно-прогностических контроллеров, которые предсказывают будущие потребности, основанные на эволюции свойств ткани. Например, если скорость потребления кислорода (рассчитанная из разницы между входным и выходным кислородным напряжением) начинает уменьшаться, контроллер может увеличить скорость потока или кислородное напряжение для предотвращения гипоксии. Подходы машинного обучения также изучаются для выявления закономерностей успешного созревания и соответственно корректировать параметры.

Интеграция мониторинга в режиме реального времени создает проблемы в управлении данными и обработке сигналов. Биореакторы генерируют большие объемы непрерывных данных, которые должны храниться, анализироваться и коррелировать с конечным качеством ткани. Облачные биореакторы, которые позволяют удаленный мониторинг и журналирование данных, становятся обычным явлением в исследовательских лабораториях, и подобные системы могут иметь важное значение для клинического производства в соответствии с правилами надлежащей производственной практики (GMP).

Расширение и перевод на клиническую практику

Переход от лабораторных биореакторов к производственным системам для клинического использования требует решения нескольких практических вопросов. Во-первых, биореактор должен быть совместим с требованиями GMP, включая материалы, которые могут быть проверены на стерильность, многократную консистенцию и прослеживаемость. Одноразовые компоненты биореактора (такие как наборы трубок и камеры) снижают риск перекрестного загрязнения и упрощают утверждение регулирующих органов. Во-вторых, система должна быть в состоянии производить конструкции согласованного качества по партиям. Переменная, введенная оператором обработки, должна быть сведена к минимуму, что доказывает высокую степень автоматизации.

В-третьих, биореактор должен вмещать различные размеры и длины сосудов, поскольку клинические потребности варьируются от коронарных трансплантатов (3-4 мм диаметром, 10-20 см длиной) до аорт (> 2 см диаметром). Модульные конструкции, которые позволяют взаимозаменяемые камеры и канюли, являются предпочтительными. В-четвертых, биореактор должен поддерживать долгосрочную культуру (4-12 недель) с минимальным обслуживанием. Надежные насосы, датчики и исполнительные механизмы, которые не дрейфуют или выходят из строя в период культивирования, необходимы. Излишние системы могут быть необходимы для критических функций, таких как доставка кислорода.

Регулятивные соображения также влияют на конструкцию биореактора. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) и Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) ожидают, что среда биореактора будет хорошо характеризоваться и что любые изменения в процессе будут проверены для обеспечения качества продукции. Биореакторы, которые включают компоненты животного происхождения (например, сыворотку крупного рогатого скота) сталкиваются с дополнительными препятствиями из-за проблем безопасности, связанных с прионами и вирусами. Разрабатываются без сыворотки или без ксено-содержащих составов среды, и конструкция биореактора должна соответствовать измененным требованиям потока и кислорода клеток, выращенных в этих условиях.

Наконец, стоимость системы биореакторов должна быть оправдана клинической пользой. В то время как современные системы дороги (десятки тысяч долларов за единицу), масштабное производство и использование компонентов, напечатанных на 3D-принтере, могут снизить затраты. Страховое возмещение за тканеинженерные сосудистые трансплантаты еще не установлено, но ранние приемники могут быть готовы платить премию за трансплантаты, которые избегают осложнений синтетических трансплантатов (например, тромбоз, инфекция, интимная гиперплазия).

Будущие направления и новые технологии

Область проектирования биореакторов для сосудистой тканевой инженерии быстро развивается. Несколько новых технологий обещают еще больше оптимизировать созревание тканей и ускорить клинический перевод.

Органо-на-чипе и микрофизиологические системы всё чаще используются для скрининга оптимальных условий культивирования перед переходом на полномасштабные биореакторы. Эти микросистемы могут воспроизводить сложное взаимодействие нескольких типов клеток, потока и циклического растяжения в уменьшенном формате. Высокопроизводительный скрининг сотен условий одновременно может идентифицировать идеальное сочетание факторов роста, механических стимулов и свойств каркаса.

Биореакторное вычислительное моделирование — это ещё одна область роста. Мультифизические модели, которые сочетают динамику жидкости, массовый транспорт и механобиологию, могут прогнозировать результаты развития тканей на основе начальных условий. Такие модели могут уменьшить количество экспериментальных испытаний, необходимых для оптимизации, и могут использоваться для разработки протоколов культуры конкретного пациента. Например, модель может имитировать, как клетки отдельного пациента (например, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) реагируют на различные режимы растяжения, что приводит к персонализированному протоколу созревания.

Беспроводные и безбатарейные датчики разрабатываются для мониторинга параметров внутри биореактора без необходимости физических разъемов, которые являются потенциальными точками входа для загрязнения. На основе индуктивной связи или ультразвуковых волн эти датчики могут передавать данные о температуре, рН, давлении и даже метаболизме клеток посредством флуоресценции. В сочетании с гибкой электроникой они могут быть встроены в каркас или стенку биореактора.

Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)-производных сосудистых клеток набирает обороты, и биореакторы должны быть адаптированы для поддержки созревания этих клеток, которые часто требуют различных факторов роста и механических сигналов, чем первичные клетки. iPSC-производные клетки гладких мышц, например, могут быть более пластичными и требуют длительной культуры с определенными растяжками для достижения сократительного фенотипа.

Наконец, биопечать и аддитивное производство объединяются с биореакторной культурой для создания сосудистых трансплантатов для конкретного пациента. Подложку можно печатать с точной геометрией и размещением клеток, а затем немедленно передавать биореактору для созревания. Некоторые лаборатории разрабатывают интегрированные системы, где биопринтер и биореактор размещены вместе, минимизируя время между печатью и перфузией. Эта интеграция уменьшает повреждение клеток и гарантирует, что печатная архитектура сохраняется в ранние часы культуры.

Внешние ресурсы для дальнейшего чтения включают в себя всеобъемлющий обзор по проектированию биореакторов в Тенденции в биотехнологии (доступно по ссылке DOI ), практическое руководство по разработке перфузионных биореакторов из Журнал визуализированных экспериментов JoVE ) и руководящий документ FDA по производству тканеинженерных продуктов FDA ссылка .

Оптимизация конструкции биореактора - это многодисциплинарное предприятие, которое сочетает в себе инженерию, клеточную биологию и материаловедение. Каждый параметр - от геометрии пути потока до алгоритма, контролирующего циклическое растяжение - должен быть настроен на конкретные требования выращиваемой ткани. Хотя проблемы остаются в масштабировании, воспроизводимости и одобрении регулирующих органов, прогресс, достигнутый за последние два десятилетия, дает убедительные доказательства того, что оптимизированные биореакторы будут краеугольным камнем клинической сосудистой тканевой инженерии. Следующее поколение систем, оснащенных датчиками в реальном времени, адаптивным контролем и автоматизацией, приблизит нас к цели готовых живых сосудистых трансплантатов, которые превосходят синтетические альтернативы и улучшают результаты лечения пациентов.