Биореакторные системы для выращивания функциональных сосудистых тканей для трансплантации

Понимание биореакторных систем: основа сердечной тканевой инженерии

Болезни сердца остаются ведущей причиной заболеваемости и смертности во всем мире, на которые приходится более 17 миллионов смертей в год. Современные методы лечения — фармакологические вмешательства, хирургическая реваскуляризация и механические вспомогательные устройства — могут управлять симптомами, но не могут восстановить потерянный функциональный миокард. Трансплантация сердца является единственной окончательной терапией для конечной стадии отказа, но дефицит донорских органов оставляет большинство пациентов в списках ожидания. Тканевая инженерия предлагает преобразующую альтернативу: создание живых, функциональных сердечных пластырей или целых органов в лаборатории для трансплантации. В основе этой революции лежит биореакторная система, сложное устройство, которое воссоздает микросреду организма, чтобы направлять клетки в формирование зрелой, сократительной сердечной ткани.

Биореакторные системы — это гораздо больше, чем простые сосуды для культивирования. Они обеспечивают точный контроль над физическими, химическими и электрическими параметрами, необходимыми для развития сердечной ткани. Температура, рН, напряжение кислорода, питание и удаление отходов постоянно регулируются. Что еще более важно, биореакторные системы обеспечивают механические и электрические стимулы, которые имитируют среду биения родного сердца, способствуя выравниванию клеток, образованию разрывов и экспрессии сократительного белка. Без этих сигналов инженерные сердечные ткани остаются незрелыми и не имеют генерации силы, необходимой для терапевтической эффективности.

Основные компоненты и операционные принципы

Типичный биореактор сердечной ткани состоит из стерильной камеры культуры, перфузионной схемы, датчиков, исполнительных механизмов и блока управления. В камере находится конструкция - часто клетки, посаженные на каркас или самосборные клеточные листы. Перфузионные насосы рециркулируют культуральную среду, обеспечивая равномерное поступление кислорода и питательных веществ в тканевое ядро. Растворившиеся датчики кислорода, зонды рН и регуляторы температуры обеспечивают обратную связь в реальном времени. Для механического кондиционирования, растягивающие механизмы (пневматические, электромагнитные или моторизованные) применяют циклическое напряжение на физиологически релевантных частотах (1-2 Гц). Электроды электрической стимуляции доставляют импульсы поля для синхронизации сокращения ткани и способствуют электрической связи.

Разработано несколько конфигураций биореакторов:

• Биореакторы перфузии: Средний поток протекает через или вокруг ткани, усиливая транспорт массы. Они подходят для толстых конструкций, где одной диффузии недостаточно.
• Биореакторы на стенках с вращающимися стенками (RWV): Созданные НАСА для исследований микрогравитации, они обеспечивают низкосдвигаемую трехмерную культуру.
• Компрессионные биореакторы: Применяют циклические сжимающие нагрузки, имитируя механическую среду стенки желудочков.Часто используемые для хряща, они теперь адаптированы для сердечной ткани.
• Электромеханические биореакторы: Объединяют как циклическое растяжение, так и электрическое растяжение, предлагая наиболее полную физиологическую мимикрию. Это текущий золотой стандарт для созревания сердечной ткани.

«Биореактор — это не просто контейнер; это инкубатор функции. Интегрируя механические и электрические сигналы, мы можем коаксировать кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток, в организованную, бьющуюся ткань, которая реагирует на лекарства и потенциально может быть привита к несостоящему сердцу». — Доктор Ненад Бурсак, Университет Дьюка (перефразировано из ]

Комбинированное электромеханическое кондиционирование дает синергетические преимущества. Например, исследование 2019 года в Биоматериалы продемонстрировали, что сердечные ткани, полученные из iPSC, кондиционированы с удвоенной силой тканей, получающих только один тип стимула. Улов: протоколы стимуляции должны быть точно рассчитаны. Начало электрического темпа слишком рано, до правильного выравнивания клеток, может вызвать дезорганизованное сокращение. Многие исследователи теперь используют поэтапный подход: сначала статическая культура для прикрепления клеток, затем механическая стимуляция для выравнивания, а затем комбинированное электромеханическое кондиционирование.

Ключевые параметры проектирования и возможности мониторинга

Создание биореактора, который надежно производит трансплантируемую сердечную ткань, требует тщательного контроля десятков переменных. Наиболее важными являются массовый транспорт, кислородное напряжение, рН, температура и стерильность. Мониторинг в реальном времени и адаптивный контроль теперь стандартны в современных системах.

Пределы транспортировки питательных веществ и кислорода

Сердечная ткань очень метаболическая — каждый кардиомиоцит потребляет кислород со скоростью примерно в 20 раз больше, чем фибробласт кожи. В статической культуре диффузия кислорода ограничена ~ 100-200 мкм от средней поверхности. Постройки толще, чем это, развивают некротическое ядро. Биореакторы перфузии решают это, заставляя среду через пористый каркас или вокруг клеточных листов, поддерживая кислород выше критических уровней (обычно > 40 мм рт.ст.). Вычислительная динамика жидкости (CFD) модели помогают проектировать скорости потока, которые максимизируют транспорт без повреждения сдвига чувствительных клеток.

Питательные градиенты также влияют на фенотип: зоны с высоким содержанием глюкозы/инсулина могут способствовать фиброзу, в то время как гипоксические области вызывают проангиогенную сигнализацию. Биореакторы с несколькими входными/выходными портами могут создавать определенные градиенты концентрации, что позволяет изучать метаболическую зонацию, аналогичную той, которая наблюдается в нативной желудочковой стенке.

Контроль восприятия и обратной связи в реальном времени

Современные биореакторы становятся «умными». Волоконно-оптические датчики кислорода, оптоды рН и мониторы роста клеток на основе импеданса обеспечивают непрерывные данные. Например, сократительная сила ткани может быть измерена с помощью отклонения гибких консольных рычагов или отслеживания смещений шариков на основе изображений. Это неинвазивное считывание позволяет исследователям оценивать функциональное созревание без разрушения конструкции. Алгоритмы замкнутого цикла регулируют скорость перфузии, амплитуду растяжения или частоту пробега в реальном времени, чтобы сохранить параметры в пределах целевых диапазонов. Машинное обучение в настоящее время применяется для прогнозирования оптимальных условий культуры на основе обратной связи датчика, уменьшая пробную и ошибочную информацию.

Стратегии отбора каркасов и посева клеток

Производительность биореактора неотделима от материала каркаса. Природные полимеры (коллаген, фибрин, желатин), синтетические полимеры (PLGA, PCL, гидрогели PEG) и децеллюляризованный внеклеточный матрикс (dECM) предлагают различные жесткость, скорости деградации и мотивы адгезии клеток. Архитектура каркаса - размер пор, взаимосвязь, выравнивание волокон - влияет на эффективность посева и перенос питательных веществ. Биореакторы могут помочь однородному посеву клеток посредством динамического вращения, перфузионного посева или электростатического притяжения. После посева биореактор поддерживает культуру, в то время как каркас ремоделирует или деградирует, оставляя ткань с плотностью клеток с минимальным посторонним материалом - идеально подходит для трансплантации.

Современные проблемы в выращивании трансплантируемых сердечных тканей

Несмотря на впечатляющие достижения в лабораторных конструкциях, перевод выращенных в биореакторе сердечных тканей в клинику сталкивается с огромными препятствиями. Решение этих проблем определит, станет ли тканевая инженерия рутинной терапией или останется экспериментальным любопытством.

Пределы васкулизации и диффузии питательных веществ

Человеческое сердце имеет плотность капилляров ~ 3000 капилляров на мм3. Инженерные сердечные конструкции толщиной более нескольких сотен микрометров не могут выжить без сосудистой сети. В то время как биореакторы улучшают транспорт массы к поверхности, глубокие ядра тканей остаются гипоксическими. Стратегии, которые изучаются, включают:

• Предваскуляризация: Сокультура кардиомиоцитов с эндотелиальными клетками и клетками гладкой мышцы, позволяющая самосборку капиллярных сетей в биореакторе. Добавление VEGF и ангиопоэтина-1 усиливает образование сосудов.
• Биореактор-опосредованная васкуляризация: Использование микрофлюидных каналов, встроенных в каркас, которые перфузируются средой, а затем выстланы эндотелиальными клетками, чтобы сформировать примитивную «циркуляторную систему».
• В естественных условиях преваскуляризация: Имплантация конструкции временно в хорошо васкуляризированный участок (как артериовенозная петля) перед окончательной трансплантацией. Биореактор служит производственной платформой, за которой следует созревание in vivo.

Каждый подход добавляет сложности и нормативного бремени.Идеальным решением может быть биореактор, который активно строит перфузионные микрососудистые сети во время культивирования — цель, преследуемая несколькими группами с использованием жертвенной биопечати и динамической перфузии.

Масштабное и биопроизводственное хозяйство

Для лечения одного пациента с сердечным пластырем потребуется ~ 1 млрд клеток. Замена всего сердца потребует на порядок больше. Современные системы биореакторов имеют масштаб исследований: они производят одну или несколько конструкций за пробег. Масштабирование до клинического производства требует автоматизации, стандартизации, снижения затрат и соблюдения надлежащей производственной практики (GMP). Начинают появляться коммерческие платформы биореакторов (например, от таких компаний, как TissueGrowth Technologies, Quorium Inc.), но они должны демонстрировать воспроизводимое качество тканей по партиям. Стоимость реагентов, особенно факторов роста и линий стволовых клеток надлежащей производственной практики (GMP) остается непомерной.

Долгосрочная стабильность и иммуногенность

Даже если сердечный пластырь функционирует хорошо in vitro, его долгосрочная выживаемость в сердце реципиента неопределенна. Имплантат должен электрически интегрироваться с хозяином миокарда (чтобы избежать аритмий), развивать кровоснабжение и противостоять иммунному отторжению. Аутологичные клетки (например, из собственных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента) избегают отторжения, но являются более практичными и трудоемкими для производства. Аллогенные «готовые» продукты более практичны, но требуют стратегии иммунного подавления или иммунной маскировки (например, инженерные клетки должны быть способны производить ткани, которые не только функциональны, но и иммунологически совместимы. Кроме того, ткань должна поддерживать структурную целостность в течение многих лет; протоколы кондиционирования биореактора должны быть проверены на долгосрочную долговечность.

Новые технологии и будущие направления

Сами биореакторы эволюционируют из пассивных камер культуры в интегрированные производственные системы, которые включают биопечать, зондирование, ИИ и передовые биоматериалы.

3D-биопечать и интеграция с органом на чипе

3D-биопечать позволяет точно осаждать клетки, гидрогели и структурные компоненты для репликации сложной архитектуры сердца. При сочетании с перфузионным биореактором печатная конструкция немедленно взращивается, позволяя созревать слой за слоем. Некоторые системы теперь интегрируют микрожидкие датчики «орган на чипе» непосредственно в биореактор, позволяя измерять сжатие тканей с высоким разрешением, скорость электрической проводимости и реакции на лекарства. Эта комбинация особенно эффективна для скрининга лекарств, где человеческие сердечные ткани в биореакторах могут предсказать токсичность раньше, чем на животных моделях.

Примечательным примером является платформа «Сердце на чипе» в Институте Висса (Гарвард), которая использует микроинженерные ткани с интегрированным зондированием. Хотя эти системы еще не в масштабе трансплантации, они информируют о разработке более крупных биореакторов, выявляя критические факторы масштабирования, такие как минимальный градиент кислорода, который все еще дает зрелую ткань.

Умные биореакторы и оптимизация на основе ИИ

Следующее поколение будет включать в себя встроенные алгоритмы машинного обучения, которые изучают оптимальные графики питания, растяжения и прокладки. Например, исследование 2022 года продемонстрировало обучение усилению, применяемое к биореактору, контролирующему растяжение: алгоритм скорректировал амплитуду деформации в ответ на измерения силы в реальном времени, что приводит к увеличению сократительных сил на 30% по сравнению с фиксированными протоколами. ИИ также может прогнозировать результаты тканей от начальных параметров клеток / каркасов, уменьшая количество необходимых экспериментов. По мере накопления данных из тысяч прогонов цифровые двойники процесса биореактора позволят виртуальное моделирование перед физическим производством.

Стволовые клетки, полученные из кардиомиоцитов и редактирования генов

Качество входных клеток имеет первостепенное значение. Наиболее перспективным источником являются индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты стволовых клеток человека (hiPSC-CMs), но они часто остаются незрелыми, напоминающими клетки плода, а не взрослых. Биореакторное кондиционирование подталкивает их к зрелости, но дальнейшее улучшение может происходить благодаря генной инженерии. CRISPR-Cas9 может стучать в мутациях, которые усиливают сократительные свойства, ускоряют циклирование кальция или придают устойчивость к гипоксии. Биореакторам затем необходимо будет приспосабливать генетически модифицированные клеточные линии под ограничения биобезопасности. Кроме того, достижения в клеточном снабжении — такие как прямое перепрограммирование сердца — могут обеспечить клетки, сопоставленные с пациентами, без прохождения плюрипотентности, снижая опухолевый риск.

Путь к клиническим переводам и регуляторным проблемам

В Соединенных Штатах FDA классифицирует инженерные сердечные ткани как комбинированные продукты (клетки плюс каркас плюс процесс биореактора). Разработчики должны продемонстрировать безопасность, стерильность, консистенцию и потенцию. Сами биореакторы становятся частью производственного процесса и должны быть проверены на соответствие GMP - включая проверку очистки, калибровку датчиков, целостность данных (21 CFR Часть 11) и управление рисками (ISO 13485).

Несколько клинических испытаний уже были проведены с использованием листов сердечных клеток или пластырей, полученных в более простых системах культивирования (например, испытание ]MORO в Японии с использованием миобластных листов. Однако в них не использовались полные электромеханические биореакторы. Первое в человеке испытание для биореакторного созревания сердечного пластыря ожидается в течение 5-10 лет, вероятно, для небольшого, не васкуляризованного пластыря, применяемого к эпикарду. Остаются проблемы: как ткань будет транспортироваться из производственного объекта в операционную? Условия биореактора должны поддерживаться до имплантации. Разрабатываются новые переносные биореакторы, способные поддерживать стерильность и стимуляцию во время транспортировки.