Биохимия ферментации: ферменты, метаболиты и микробные взаимодействия

Ферментация является одним из старейших биохимических процессов, используемых людьми, начиная с тысяч лет производства хлеба, пива, вина, йогурта и сыра. В своей основе ферментация представляет собой анаэробный метаболический путь, в котором микроорганизмы, такие как дрожжи, бактерии и плесень, превращают органические молекулы, в первую очередь углеводы, в энергию и конечные продукты. Эти конечные продукты, которые включают этанол, молочную кислоту, углекислый газ и множество других метаболитов, дают ферментированным продуктам и напиткам их характерные вкусы, текстуры и консервирующие качества. Понимание биохимии, лежащей в основе ферментации, включает изучение конкретных ферментов, которые приводят к этим реакциям, разнообразных метаболитов, произведенных и сложных взаимодействий между микробными сообществами. Это знание не только помогает улучшить традиционные методы ферментации, но также позволяет разрабатывать новые продукты и промышленное применение.

Ключевые ферменты в ферментации

Ферменты — это биологические катализаторы, ускоряющие химические реакции, позволяющие ферментации протекать с биологически релевантными скоростями. При ферментации ферменты расщепляют сложные субстраты (например, крахмалы, белки и жиры) на более простые соединения, а затем дополнительно преобразуют эти промежуточные соединения в конечные метаболиты. Специфика и активность этих ферментов определяют эффективность ферментации и профиль конечных продуктов. Ниже мы рассмотрим наиболее важные группы ферментов, участвующие в различных путях ферментации.

Амилазы

Амилазы — это ферменты, которые гидролизуют крахмал на более мелкие сахарные единицы. Крахмал, полисахарид, состоящий из мономеров глюкозы, связанных α-1,4 и α-1,6 гликозидными связями, является общим субстратом во многих ферментациях, особенно в том, что касается зерен и клубней. Существует три основных типа:

Источники амилаз включают прорастанный ячмень (соль), микробные культуры (например, Aspergillus niger, Bacillus subtilis) и добавленные ферментные препараты в промышленных процессах. На их активность влияют рН, температура и присутствие ингибиторов, таких как ионы металлов. Оптимизация активности амилазы может значительно увеличить ферментируемые урожаи сахара.

Алкоголь дегидрогеназа

Алкогольдегидрогеназа (АДГ) является ключевым ферментом в алкогольной ферментации. Она катализирует обратимое снижение ацетальдегида до этанола, используя НАДГ в качестве кофактора. Реакция является заключительным этапом в гликоличественном пути в анаэробных условиях, где пируват сначала декарбоксилируют до ацетальдегида пируватдекарбоксилазой (ПДХ). АДГ затем передает ион гидрида из НАДГ в ацетальдегид, производя этанол и НАД+, который перерабатывается для гликолиза.

У дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, существует множество изозимов ADH, каждый с различными кинетическими свойствами и субклеточными местоположениями. Основные изоформы (ADH1, ADH2, ADH3) регулируются уровнями глюкозы и доступностью кислорода. Например, ADH1 экспрессируется при брожении, в то время как ADH2 индуцируется в респираторных условиях для окисления этанола обратно в ацетальдегид. Баланс между этими ферментами определяет выход этанола и толерантность. У молочнокислых бактерий некоторые штаммы также обладают активностью алкогольдегидрогеназы, способствуя образованию следовых спиртов в ферментированных молочных продуктах.

Дегидрогеназа лактата

Лактатдегидрогеназа (LDH) является центральным ферментом при ферментации молочной кислоты. Она катализирует редукцию пирувата в молочную кислоту в сочетании с окислением NADH в NAD+. Эта реакция регенерирует NAD+, необходимый для продолжения гликолиза, позволяя клетке вырабатывать АТФ в отсутствие кислорода. LDH существует в нескольких формах, с различной специфичностью для разных стереоизомеров:

В гомоферментативных молочнокислых бактериях (например, ]Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, LDH преобразует почти весь пируват в лактат, получая лишь небольшое количество других метаболитов.Левконосток мезентероиды) дополнительные ферменты, такие как фосфокетолаза, приводят к смешению продуктов, включая лактат, этанол и углекислый газ. Тип LDH и его регуляция существенно влияют на кислотность и вкус ферментированных молочных и растительных продуктов.

Другие важные ферменты в ферментации

Помимо трех основных групп, многие другие ферменты способствуют сложности ферментации:

Взаимодействие этих ферментов, наряду с их регулированием факторами окружающей среды, определяет окончательный состав ферментированного продукта. Достижения в ферментологии позволяют производителям адаптировать результаты ферментации, например, используя генетически модифицированные штаммы или добавляя экзогенные ферменты для увеличения урожайности или изменения вкусовых профилей.

Метаболиты, вырабатываемые во время ферментации

Метаболиты — это химические соединения, вырабатываемые или потребляемые в ходе обменных процессов. При ферментации первичные метаболиты — это те, которые непосредственно участвуют в росте и выработке энергии, в то время как вторичные метаболиты часто синтезируются после фазы экспоненциального роста и могут иметь экологические или сенсорные роли.Накопление специфических метаболитов придает каждому ферментированному продукту свои уникальные свойства.

этанол

Этанол является основным метаболитом в алкогольной ферментации, вырабатываемой дрожжами и некоторыми бактериями. Это летучий, бесцветный спирт, который способствует опьяняющему и сенсорному воздействию напитков, таких как пиво, вино и спирты. Концентрация этанола в ферментациях ограничена переносимостью продуцирующего организма; типичные штаммы S. cerevisiae по объему могут выживать до 15-18% этанола, в то время как некоторые специализированные штаммы могут переносить более высокие уровни. Этанол также действует как консервант, ингибируя рост микробов порчи, и он способствует извлечению ароматических соединений из сырья.

Во время ферментации этанол сопровождается другими летучими соединениями, такими как более высокие спирты (фюзеляжные спирты), эфиры и альдегиды, которые отвечают за ароматический профиль.На соотношение этанола к этим конгенерам влияют штамм дрожжей, температура и состав питательных веществ.

молочная кислота

Молочная кислота — это гидроксикислота, придающая тангированному, кислому вкусу ферментированные продукты, такие как йогурт, квашеная капуста, кимчи и кисломолочный хлеб. Она вырабатывается молочнокислыми бактериями (LAB) посредством уменьшения пирувата. Молочная кислота имеет два оптических изомера: L-молочная кислота (естественно вырабатывается в мышцах человека и распространена в молочных ферментациях) и D-молочной кислоты (более распространена в ферментированных овощах и некоторых бактериальных штаммах). Наличие молочной кислоты снижает рН пищи, что не только способствует ароматизации, но и повышает безопасность путем ингибирования патогенных бактерий.

В дополнение к своей сенсорной роли молочная кислота является ценным промышленным соединением, используемым в биопластиках (полимолочная кислота, PLA), загаре и в качестве регулятора pH. Метаболические пути, ведущие к молочной кислоте, также используются в производстве ферментированного корма и силоса.

Диоксид углерода

Углекислый газ (CO2) — это газ, образующийся во время многих путей ферментации. При алкогольной ферментации CO2 выделяется во время декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида. Этот газ отвечает за пузырьки в игристых винах, пиве и шампанском, и он вызывает рост теста на хлеб, образуя газовые карманы, которые расширяются во время выпечки. При молочнокислой ферментации гетероферментативные виды производят CO2 вместе с лактатом, способствуя отслоению некоторых ферментированных напитков, таких как комбуча и открытая текстура некоторых сыров.

СО2 также действует как естественный консервант в некоторых продуктах, создавая анаэробную среду, которая подавляет аэробные организмы порчи.В промышленной ферментации восстановление и повторное использование СО2 важны для усилий по обеспечению устойчивости.

Другие метаболиты

Многие другие метаболиты производятся в меньших количествах, но критически влияют на характер ферментированных продуктов:

  • Уксусная кислота: Продуцируется уксусно-кислотными бактериями (например, Ацетобактерия ) посредством окисления этанола. Он придает уксусу его острый вкус и также присутствует в кислом пиве и комбуче.
  • Диацетил: Соединение с масляным вкусом, образованное некоторыми молочнокислыми бактериями (например, Lactococcus lactis subsp. lactis biovardiacetylactis) Желательно в культивируемом масле, пахте и некоторых сырах, но может быть дефектом в пиве.
  • Ацетальдегид: Промежуточный продукт в алкогольной и молочной ферментации, он вносит зеленый яблоко или травянистый аромат при низких концентрациях, но может быть неприятным при высоких уровнях.
  • Пропионовая кислота: Пропионная кислота: Пропионокислота, производимая пропионибактериями во время созревания сыров швейцарского типа, придает им ореховый, слегка сладкий аромат.
  • Бутириновая кислота: Производится некоторыми клостридийными видами в анаэробных условиях; имеет прогорклый, сырный запах. Его присутствие в некоторых ферментированных продуктах может быть желательным (например, в некоторых выдержанных сырах) или признаком порчи.
  • Витамин и аминокислоты: Микробы могут синтезировать витамины группы В (например, фолат, рибофлавин) и свободные аминокислоты во время ферментации, повышая питательную ценность конечного продукта.

На баланс этих метаболитов влияют микробный консорциум, состав субстрата и параметры ферментации.Понимание этих взаимосвязей позволяет ученым-пищеводам проектировать процессы ферментации, которые последовательно производят желаемые сенсорные атрибуты.

Микробные взаимодействия в ферментации

Ферментация редко включает в себя один микроорганизм; вместо этого это динамический процесс, управляемый сложными микробными сообществами. Эти сообщества взаимодействуют через различные механизмы, включая синергию, конкуренцию и ингибирование. Результат этих взаимодействий определяет эффективность ферментации, безопасность продукта, а также окончательный вкус и текстуру.

синергия

Синергетические взаимодействия возникают, когда два или более микроорганизмов взаимодействуют для достижения результата, который ни один из них не может достичь в одиночку. Классические примеры включают:

  • Ферментация сульфата: Дикие дрожжи (например, Saccharomyces exiguus или Candida milleri) и молочнокислые бактерии (например, Lactobacillus sanfranciscensis]) образуют стабильный консорциум. Дрожжи ферментируют сахара для получения CO2 и этанола, в то время как LAB вырабатывают молочную кислоту и уксусную кислоту, снижая рН и способствуя тангированному вкусу. LAB также выделяют мальтозу, которая затем используется дрожжами. Этот мутуализм приводит к последовательному росту и характерной кислости.
  • Комбуча: Используется симбиотическая культура бактерий и дрожжей (SCOBY). Дрожжи превращают сахарозу в глюкозу и фруктозу и производят этанол; уксусные кислоты затем окисляют этанол до уксусной кислоты, производя терпкий аромат. Кроме того, бактерии, продуцирующие целлюлозу, образуют пелликул, который помогает поддерживать уровень кислорода и стабильность.
  • Кефир:] Кефирное зерно содержит сложную смесь бактерий LAB, дрожжей и уксусной кислоты, встроенных в полисахаридную матрицу. Бактерии молочнокислых кислот производят молочную кислоту и экзополизахариды, дрожжи способствуют этанолу и CO2, а бактерии уксусной кислоты производят уксусную кислоту. Эта синергия создает шипучий, слегка алкогольный и кислый напиток.

Конкурс

Микроорганизмы в среде ферментации конкурируют за ограниченные ресурсы, такие как сахара, источники азота, витамины и кислород.Конкурентные взаимодействия могут влиять на ход ферментации:

  • Конкуренция за питательные вещества: При спонтанном брожении ранние колонизаторы могут потреблять доступные сахара и изменять рН, что делает условия неблагоприятными для более поздних видов. Например, при брожении вина, местные дрожжи (например, Hanseniaspora) инициируют брожение, но постепенно вытесняются S. cerevisiae, который более устойчив к этанолу и эффективен при поглощении сахара.
  • Производство ингибирующих соединений: Некоторые микробы выделяют бактериоцины, органические кислоты или перекись водорода, которые препятствуют росту конкурентов. Лактобациллы Виды квашеной капусты вырабатывают молочную кислоту, которая снижает рН, подавляя порчу бактерий.
  • Селективные давления: Температура, рН и концентрация соли (как при ферментации рассола) создают селективные среды, благоприятствующие определенным организмам.В брожении мисо и соевого соуса высокое содержание соли выбирает для галотолерантных дрожжей и бактерий, таких как Zygosaccharomyces rouxii и Pedococcus halophilus.

Конкуренция может быть полезной, когда она предотвращает рост патогенов, но она также может привести к застрявшим или вялым ферментациям, если доминирующий штамм плохо адаптирован.В промышленной ферментации чистые стартовые культуры часто используются для контроля конкуренции и обеспечения предсказуемых результатов.

ингибирование

Ингибирующие взаимодействия включают в себя одно вещество, производящее микробы, которые непосредственно подавляют рост или метаболизм других. Это может быть естественным механизмом доминирования в экологической нише:

  • Производство органических кислот: Молочная кислота и уксусная кислота снижают внутриклеточный рН чувствительных микробов, ингибируя их рост. Это основная причина использования молочнокислых бактерий в качестве стартовых культур — они создают кислую среду, которая предотвращает порчу и пролиферацию патогенов.
  • Бактериоцины: Это антимикробные пептиды, продуцируемые некоторыми бактериями, такими как низин (от Lactococcus lactis), который убивает многие грамотрицательные бактерии.
  • Этанол и CO2: Высокие концентрации этанола токсичны для многих бактерий и грибов, поэтому алкогольные напитки остаются стабильными после завершения ферментации. CO2 также создает анаэробную среду, которая ингибирует аэробные организмы порчи.
  • Пероксид водорода и кислородные радикалы: Некоторые LAB производят перекись водорода в аэробных условиях, что может ингибировать каталазно-отрицательных конкурентов.

Ингибирование — обоюдоострый меч: хотя оно помогает сохранить пищу, оно также может препятствовать желаемой микробной деятельности. Например, при ферментациях смешанной культуры, таких как ферментация сыра, требуется тщательное управление ингибированием, чтобы обеспечить рост полезной вторичной флоры.

Виды путей ферментации

Ферментацию можно классифицировать на основе первичного метаболического пути и основных конечных продуктов. К наиболее распространенным типам относятся:

Алкогольная ферментация

Проводимый в основном дрожжами (например, ]Saccharomyces cerevisiae) и некоторыми бактериями, этот путь превращает глюкозу в этанол и углекислый газ. Он используется в производстве алкогольных напитков (пива, вина, спиртных напитков), а также биоэтанола для топлива. Общая реакция: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2.

Молочная кислотная ферментация

Выполняется молочнокислыми бактериями (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc и др.) и некоторыми грибами. В гомоферментативном LAB пируват сводится исключительно к лактату; в гетерогенерментативном LAB образуются дополнительные продукты, такие как этанол, ацетат и CO2. Эта ферментация имеет решающее значение для молочных продуктов (йогурт, сыр), овощей (сауэркраут, соленья), отвержденного мяса и закваски.

Ацетическая кислотная ферментация

Бактерии ацетобактерии (например, ]Ацетобактерия , Глюконобактер ) окисляют этанол до уксусной кислоты в аэробных условиях. Это вторая стадия производства уксуса после алкогольной ферментации. Ферментация ацетической кислоты также участвует в производстве комбучи и некоторых кислых сортов пива.

Бутириковая кислотная ферментация

Некоторые виды клостридиев (например, ]Clostridium butyricum ) ферментационных сахаров и других органических соединений к бутировой кислоте, наряду с водородом, CO2, а иногда и уксусной кислотой. Бутириновая кислота отвечает за прогорклые запахи в испорченной пище и также производится в рубце и в некоторых ферментациях сыра (например, швейцарский сыр), где она способствует ароматизации.

Смешанная кислотная ферментация

Общий в кишечных бактериях (например, ] Escherichia coli), этот путь дает смесь органических кислот (лактат, ацетат, сукцинат) и нейтральных продуктов (этанол, CO2, водород). Соотношение продуктов зависит от микробного штамма и условий окружающей среды.

Факторы, влияющие на эффективность ферментации

Успех ферментации зависит от контроля нескольких ключевых параметров:

  • Температура: Каждый микроорганизм имеет оптимальный температурный диапазон. Например, мезофильные LAB процветают при 30–37°C, в то время как термофильные штаммы, используемые в йогурте (]Streptococcus thermophilus) предпочитают 42–45°C. Отклонения могут замедлять метаболизм или производить нежелательные вещества.
  • pH: Большинство ферментативных микробов активны в слегка кислом до нейтрального pH, но многие LAB могут переносить pH до 3,5. Начальный pH субстрата и кислоты, вырабатываемой во время ферментации, влияют на активность ферментов и микробную конкуренцию.
  • Концентрация субстрата: Высокие уровни сахара могут вызывать осмотический стресс и снижать жизнеспособность дрожжей, в то время как низкие уровни могут ограничивать рост. Аналогичным образом, доступность азота влияет на деление клеток и синтез ароматических соединений.
  • Кислород: Ферментация обычно анаэробна, но некоторым микробам (например, уксусно-кислотным бактериям) требуется кислород.В смешанных ферментациях кислород может быть ограничен для поддержания анаэробной среды для желаемых организмов.
  • Размер инокулума: Начальное количество микроорганизмов влияет на скорость ферментации и способность вытеснять штаммы порчи. Слишком малый инокул может привести к более длительной отставанию фазы и риску загрязнения.

Благодаря точной настройке этих параметров производители могут оптимизировать урожайность, минимизировать изменчивость продукта и обеспечить безопасность пищевых продуктов. Расширенные методы мониторинга (например, рН в реальном времени, температура и анализ газа) все чаще используются в промышленной ферментации.

Промышленные и пищевые применения

Принципы ферментационной биохимии применяются во многих отраслях промышленности:

  • Производство продуктов питания и напитков: От сыра и йогурта до пива, вина и хлеба традиционные ферментации зависят от взаимодействия ферментов и микробов.Современная биотехнология позволила развить стартовые культуры с предсказуемой производительностью.
  • Биотопливо: Алкогольная ферментация является основой для производства биоэтанола из сельскохозяйственных культур (кукуруза, сахарный тростник) и лигноцеллюлозного сырья. Ферменты, такие как целлюлозы и амилазы, используются для сахаризации биомассы перед ферментацией.
  • Производство органической кислоты: Молочная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота (через Aspergillus niger), и итаконовая кислота производятся путем ферментации для использования в пищевых продуктах, фармацевтических препаратах и биопластиках.
  • Фармацевтические и нутрицевтические препараты: Ферментация используется для производства антибиотиков (например, пенициллина из Penicillium chrysogenum), витаминов (B2, B12), ферментов (реннет для сыра) и биологически активных пептидов.
  • Обработка отходов и биоремедиация: Смешанные микробные ферментации могут разрушать органические отходы в анаэробных дигестерах, производя биогаз (метан и CO2) в качестве возобновляемого источника энергии.

Последствия для здоровья ферментированных продуктов

Ферментированные продукты были связаны с различными преимуществами для здоровья, в основном связанными с наличием живых микробов (пробиотиков), биологически активных метаболитов и улучшенной биодоступностью питательных веществ:

  • Пробиотики: Живые LAB и дрожжи в ферментированных молочных продуктах, кимчи и комбуча могут положительно влиять на микробиоту кишечника, потенциально улучшая пищеварение и иммунную функцию.
  • Усиление поглощения питательных веществ: Ферментация разрушает антинутриенты (например, фитиновую кислоту в зернах) и увеличивает уровень витаминов группы В, свободных аминокислот и минералов.
  • Снижение токсинов: Некоторые микробы могут разрушать микотоксины и другие вредные соединения, присутствующие в сырье.
  • Потенциальные риски: Некоторые ферментированные продукты могут содержать высокие уровни гистамина или других биогенных аминов, которые могут вызывать побочные реакции у чувствительных лиц.Кроме того, непастеризованные продукты могут содержать патогены, если ферментация неконтролируема.

В целом, потребление традиционно ферментированных продуктов, как правило, безопасно и полезно при производстве в гигиенических условиях. Дальнейшие исследования продолжают раскрывать молекулярные механизмы, лежащие в основе этих последствий для здоровья.

Заключение

Биохимия ферментации раскрывает сложную сеть ферментативных реакций, производства метаболитов и микробных взаимодействий, которые были усовершенствованы эволюцией и адаптированы людьми для кулинарных и промышленных целей. От простого преобразования сахаров в этанол или молочную кислоту до сложного сосуществования дрожжей и бактерий в симбиотических культурах, каждый шаг регулируется биохимическими принципами, которыми можно манипулировать для улучшения качества и консистенции продукта. Путем углубления нашего понимания этих процессов - путем изучения кинетики ферментов, метаболических путей и микробной экологии - мы можем продолжать внедрять инновации в производстве продуктов питания, топлива и фармацевтических препаратов, используя силу ферментации для устойчивого будущего.