Table of Contents

Успешная регенерация функциональных толстых тканей остается центральной целью в регенеративной медицине. В то время как тонкие ткани, такие как кожа, могут поддерживаться диффузией, более крупные конструкции, такие как сердечные пластыри, дольки печени или сегменты почек, требуют функциональной микрососудистой системы для доставки кислорода и питательных веществ и удаления отходов. Биореакторы предлагают жестко контролируемую среду для руководства созреванием тканей, при этом поток жидкости является основным инструментом для доставки биохимических стимулов и газообмена. Однако поток жидкости создает нагрузку на поверхности растущих клеток и каркасов. Понимание и точное управление стрессом, вызванным биореактором, возникло как критический фактор в направлении поведения эндотелиальных клеток и стимулировании формирования устойчивых, перфузионных сосудистых сетей. Способность использовать эту физическую силу имеет ключ к масштабированию тканевой инженерии от тонких, сосудистых конструкций до сложных, жизнеспособных замен органов.

Динамика жидкости сдвига стресса в биореакторах

Стресс сдвига, в контексте биореактора, является тангенциальной силой, оказываемой движущейся жидкостью (культурной средой) на поверхности клеток или каркаса. Он математически определяется как напряжение сдвига стенки (WSS), представленное уравнением τ = μ (∂u/∂y) | w , где μ — динамическая вязкость жидкости, а ∂u/∂y — градиент скорости (скорость напряжения) на стенке. Этот физический параметр отличается от гидростатического давления и непосредственно влияет на клеточную морфологию, выравнивание и экспрессию генов.

Режим потока в биореакторе — ламинарный или турбулентный — драматически влияет на распределение WSS. Ламинарный поток, характеризующийся низким числом Рейнольдса (Re < 2000 для внутренних потоков), предсказуем и генерирует однородное, четко определенное поле сдвига. Турбулентный поток с его хаотическими вихрями и флуктуациями скорости создает очень неоднородную и часто повышенную среду WSS. Большинство приложений тканевой инженерии нацелены на ламинарный поток для консистенции, хотя турбулентное смешивание в колбах спиннера иногда используется для начального посева клеток.

Различные конфигурации биореакторов производят различные профили напряжения сдвига. Перфузионные биореакторы Насосные среды непосредственно через поры 3D-кадров. Эта конфигурация обеспечивает наиболее прямое управление, поскольку скорость потока может быть модулирована для достижения целевого WSS на просвете инженерных сосудов или на клетках, выстилающих каналы каркаса. Спиннерные колбы биореакторы полагаются на магнитную полосу сдвига для создания турбулентного поля потока, что приводит к высокому сдвигу на краях конструкций, но потенциально неравномерному сдвигу в интерьере. Вращающиеся стенки сосуда (RWV) биореакторы, вращая всю камеру культуры, что приводит к чрезвычайно низким и мягким напряжениям сдвига, идеально подходящим для чувствительных типов клеток или начального формирования агрегата, но менее эффективным для продвижения зрелых, адаптированных к потоку сосудов.

Эндотелиальное механосенсорное взаимодействие: первичный интерфейс

Биологическое воздействие сдвига опосредуется механотрансдукцией, процессом, посредством которого клетки преобразуют механические силы в биохимические сигналы. Эндотелиальные клетки (ЭК), которые выстилают все кровеносные сосуды, исключительно чувствительны к потоку. Первичный сенсорный аппарат включает в себя несколько взаимосвязанных компонентов на поверхности клетки.

Гликокаликс

Гликокаликс представляет собой слой протеогликанов, гликопротеинов и гликозаминогликанов на апикальной поверхности эндотелиальных клеток. Он выступает в просвет и является первой структурой, деформирующейся под потоком. Эта деформация передает силу цитоскелету кортикального актина. Деградация гликокаликса, которая может происходить в высокосдвигающихся или воспалительных средах, сильно ухудшает способность клетки ощущать и реагировать на поток, часто приводя к патологическому сосудистому ремоделированию.

Первичная Килия

Первичные реснички являются сингулярными, неподвижными органеллами, которые действуют как механосеноры во многих типах клеток. На эндотелиальных клетках, особенно в областях с низким или нарушенным потоком, цилий изгибается под напряжением сдвига, вызывая приток ионов кальция (Ca]2+]. Этот кальциевый сигнал активирует каскад событий, включая производство оксида азота (NO) и активацию киназ, которые регулируют экспрессию генов. Интересно, что первичные реснички обычно рассасываются в областях высокого, устойчивого ламинарного потока, что предполагает сложную роль в распознавании переходов в среде потока.

Мембранные рецепторы комплексов

Хорошо зарекомендовавший себя механосенсорный комплекс на поверхности эндотелиальных клеток включает PECAM-1 VE-кадгерин и VEGFR2 (Васкулярный эндотелиальный фактор роста Рецептор 2]. При нажатии на сдвиговой стресс PECAM-1 непосредственно передает физическую силу. Это активирует сигнальный каскад, который включает в себя семейство киназ Src и приводит к трансактивации VEGFR2, независимо от его лиганда VEGF. Эта лиганд-независимая активация является мощным драйвером выживания, миграции и выравнивания клеток. Одновременно интегрины на базальной поверхности клетки соединяют внеклеточный матрикс с внутренним цитоскелетом, обеспечивая каркас для передачи силы.

Внутриклеточные сигналы и транскрипционная регуляция

Вниз по течению от этих датчиков сдвиговый стресс активирует путь PI3K/Akt, приводящий к фосфорилированию эндотелиальной оксида азота синтазы (eNOS) и производству NO. NO является мощным сосудорасширяющим средством и ключевой проангиогенной молекулой. Сдвигающий стресс также сильно повышает фактор транскрипции Kruppel-подобный фактор 2 (KLF2), который организует противовоспалительный, антитромботический и про-зрелый ген экспрессии программы. KLF2 повышает регуляции eNOS и тромбомодулина, подавляя молекулы адгезии, такие как VCAM-1 и E-селетин, создавая эндотелий, который является стабильным и реагирующим на ангиогенные сигналы.

Бифазный доза-ответ: оптимальный против патологического сдвига

Связь между величиной сдвига напряжения и сосудистым образованием не линейна, а двухфазна. Существует окно оптимального WSS, способствующее устойчивому ангиогенезу и созреванию сосудов, вне которого сосудистое развитие скомпрометировано или дезорганизовано.

Зона Златовласки для сосудистой формации

Умеренные уровни ламинарного сдвига, обычно в диапазоне 5—20 дина/см2, сильно способствуют проангиогенному фенотипу.В этих условиях эндотелиальные клетки выравниваются в направлении потока, критический шаг для формирования трубчатых структур с заданным просветом. Этот диапазон сдвига стимулирует выработку матричных металлопротеиназ (ММР), которые реконструируют окружающую матрицу для создания пространства для прорастания сосудов. Он также синергизирует с сигнализацией VEGF для повышения стабильности сосудов. Перициты и клетки гладкой мышцы, которые часто совместно культивируются для стабилизации инженерных микрососудов, также более эффективно набираются в таких условиях потока, поскольку сдвига напряжение на ECs способствует секреции PDGF-BB.

Механизмы повреждения сосудов при аномальном сдвига

На крайних участках спектра сдвига активно подавляется сосудистое образование. Патологически высокий сдвигающий слой (>50 дина/см2) может вызвать механическую травму, приводящую к чрезмерному NO-продуцированию, приводящую к нитрозотному напряжению и дестабилизации сосуда. И наоборот, низкое сдвигающее напряжение (<1 dyn/cm²) или статические условия не обеспечивают необходимого механического стимула для дифференциации.<1 dyn/cm²) При статических условиях ЭК не выравнивается, и они часто образуют дезорганизованные, протекающие сети с плохой долгосрочной стабильностью. Эти незрелые сосуды склонны к регрессии при удалении из поддерживающей матрицы. осцилляторный или нарушенный поток, часто встречающийся в точках сосудистой ветви in vivo, является высоко атерогенным. В биореакторе непреднамеренные

Применение в регенеративной медицине и моделировании заболеваний

Способность программировать сдвигающий стресс напрямую приводит к улучшению производительности инженерных тканей в доклинических моделях и платформах орган-на-чипе.

Пред-васкуляризующие ткани для трансплантации

Одним из основных препятствий в создании толстых, трансплантируемых тканей является обеспечение быстрого анастомоза (связи) с кровеносной системой хозяина.За счет предварительного формирования функциональной микрососудистой сети в биореакторе время, необходимое для вторжения сосудов хозяина в имплантат, резко сокращается.

  • Кардиакальные пятна: Биореакторы перфузии, имитирующие механическую среду сердца — сочетающие циклический растяжение с пульсативным потоком — были использованы для создания плотно васкуляризированных сердечных пластырей. Эти пластыри быстро интегрируются и улучшают функцию сердца в моделях инфаркта миокарда у животных.
  • Конструкции тканей печени: Синусоиды печени естественным образом подвергаются воздействию различной низкосдвигающей, высокометаболической среды. Биореакторы, предназначенные для воспроизведения этого специфического профиля потока, позволили культивировать первичные гепатоциты наряду с эндотелиальными клетками, что привело к стабильным, продуцирующим альбумин органоидам печени с функциональными желчными каналами.
  • Костные трансплантаты: Стресс сдвига не только стимулирует образование сосудов, но и усиливает дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МСК) по остеогенной линии. Было показано, что биореакторы перфузии, которые способствуют WSS 1-10 дина / см2, генерируют высоко минерализованные, васкуляризованные костные конструкции, которые легче интегрируются в бедренные дефекты.

Недавние достижения в разработке перфузионных биореакторов были сосредоточены на создании пространственно контролируемых градиентов сдвига для создания как костных, так и сосудистых отделений в рамках одной конструкции.

Модели Organ-on-a-Chip для скрининга лекарств

Точность микрофлюидной перфузии делает платформы орган-на-чипе идеальными для изучения эффектов сдвига на васкуляризацию в высокопроизводительном режиме. Эти устройства состоят из микроканалов, выстланных эндотелиальными клетками, часто в кокультуре с другими орган-специфичными клетками (например, гепатоцитами, кардиомиоцитами, нейронами).

  • Биологическая точность: Применяя физиологические режимы потока (например, 5-10 дина/см2 для артериальной, 1-4 дина/см2 для венозной), эти чипы могут рекапитулировать зависящую от потока функцию гематоэнцефалического барьера или барьера клубочковой фильтрации намного лучше, чем статические анализы Трансвелла.
  • Ангиогенезные анализы: Лаборатории на чипах позволяют исследователям точно установить химический градиент (например, VEGF) в присутствии контролируемого потока. Это позволяет визуализировать, как сдвиговое напряжение направляет направление и скорость ангиогенного прорастания.
  • Моделирование болезни: Путем воздействия эндотелия на патологические структуры потока (например, нарушенный поток из стенотического канала), исследователи могут моделировать инициирование атеросклероза или протекающую сосудистую систему солидной опухоли, обеспечивая платформу для скрининга антиангиогенных или сосудистых нормализующих препаратов.

Эти платформы подробно рассматриваются в в этом обзоре моделей васкуляризированных органов на чипе , который подчеркивает критическую роль механических сил в достижении физиологической значимости.

Вычислительные подходы к оптимизации стресса сдвига

Учитывая сложность геометрии 3D-каркасов и сложность экспериментального измерения WSS в клеточном масштабе, вычислительное моделирование стало незаменимым инструментом для проектирования биореакторов.

Вычислительная динамика жидкости (CFD)

Программное обеспечение CFD может имитировать поля скорости и сдвига напряжения в любом биореакторе или геометрии каркаса. Вводя пористость каркаса, размер пор и вязкость среды, исследователи могут предсказать области высокого и низкого сдвига перед изготовлением конструкции. Это позволяет итеративную конструкцию сетей каналов каркаса для обеспечения равномерного распределения WSS, уменьшая присутствие «мертвых зон», где сосуды не могут сформировать. Модели CFD были очень эффективными в разработке перфузионных систем для оптимизации сдвига напряжения для васкуляризированной костной ткани инженерии .

Машинное обучение и адаптивный контроль

Следующим рубежом является контроль замкнутого цикла биореакторов. Интегрируя датчики реального времени (для pH, pO2, глюкозы, лактата) с алгоритмами машинного обучения, будущие биореакторы могут динамически регулировать скорости потока для поддержания WSS в оптимальном ангиогенном диапазоне. Например, по мере роста ткани пористые пространства становятся закупоренными новой матрицей и сосудами, повышая устойчивость к потоку и изменяя местную WSS. Адаптивная система управления может реагировать на эти изменения, предотвращая повреждение сдвига, продолжая обеспечивать адекватный конвективный транспорт. Такие системы активно разрабатываются для обработки присущей сложности васкуляризованных органоидных культур .

Проблемы на пути к клиническому переводу

Несмотря на значительный прогресс, остается несколько проблем, прежде чем кондиционированные сосудистые сети с сдвиговым стрессом станут обычной клинической реальностью.

Масштабируемость и производство

Масштабирование от тонкого, проницаемого для среды каркаса до толстой конструкции размером с орган остается нетривиальным. Падения давления, необходимые для пропитки большой плотной ткани, могут стать огромными, что приведет к обрушению канала или чрезмерному сдвига на входе. Разработка надежных, стерильных и простых в использовании перфузионных систем, подходящих для надлежащей производственной практики (GMP), является основным инженерным препятствием. Материалы, используемые для самого биореактора, должны быть биосовместимыми и способными выдерживать повторную стерилизацию.

Динамический поток и механические сигналы

В большинстве современных исследований используется устойчивый однонаправленный поток. Однако кровоток в организме является пульсативным и часто циклическим (систола/диастола). Появляющиеся данные свидетельствуют о том, что частота и амплитуда пульсативного потока обеспечивают дополнительные сигналы, которые стабилизируют эндотелий и способствуют надлежащей артериально-венозной спецификации. Интеграция этих сложных форм волн в биореактор технически требовательна, но, вероятно, необходима для созревания действительно функциональных артерий и вен в инженерной ткани.

Интеграция с принимающей васкулатурой

Даже самые хорошо сформированные инженерные микрососуды должны в конечном итоге подключаться к кровообращению пациента. Этот процесс, известная иноскуляции, опирается на ангиогенные сосуды хозяина, вторгающиеся в имплантат и слияние с предварительно сформированной сетью. На реакцию хозяина влияют воспалительное состояние, наличие остаточного напряжения сдвига (что подавляет воспаление) и высвобождение хемоаттрактантов. Считается, что предварительная кондиционирование имплантата при оптимальном сдвигах делает инженерные сосуды более «дружественными к приглашению» путем подавления молекул адгезии и содействия зрелому, спокойному фенотипу. Понимание того, как оптимизировать эту передачу от биореактора к хозяину, является заключительным критическим шагом. Молекулярные пути, участвующие, были подробно описаны в статье «Ежегодный обзор биомедицинской инженерии» по сосудистой механотрансдукции .

Заключение

Взаимодействие между напряжением сдвига жидкости и сосудистым морфогенезом является определяющим параметром в тканевой инженерии. Переводя принципы механотрансдукции в надежные конструкции биореакторов, исследователи получают возможность направлять эндотелиальные клетки для формирования сложных, стабильных и перфузионных сетей, необходимых для выживания толстых тканей. Намеренное применение правильного режима сдвига - ни слишком высокого, ни слишком низкого - является ключом, который открывает переход от статических тканевых конструкций к динамическим, функциональным заменам органов. По мере созревания вычислительного моделирования и технологий управления замкнутым контуром надежное производство пациент-специфичных, предваскуляризированных тканей для трансплантации приближается к клинической реальности, фундаментально меняя будущее регенеративной медицины.