Инженерия костной ткани стоит на пересечении материаловедения, клеточной биологии и биомеханики, стремясь восстановить или заменить поврежденную кость, вызванную травмой, болезнью или возрастной дегенерацией. Центральной проблемой в этой области является направление стволовых клеток в остеобласты - специализированные клетки, которые образуют новую кость. В то время как биохимические факторы, такие как факторы роста и гормоны, являются хорошо установленными регуляторами, механические стимулы появились в качестве одинаково мощных факторов судьбы стволовых клеток. Физические силы, которые испытывают кости во время повседневной деятельности - сжатие от стояния, напряжение от мышечных сокращений, сдвиг от потока жидкости в лакунах - не просто случайны; они являются важными сигналами, которые направляют дифференцировку стволовых клеток. Понимание и репликация этих механических сигналов в инженерных конструкциях имеет решающее значение для достижения функциональной регенерации костей. В этой статье исследуется, как сжатие, напряжение и сдвиговый стресс управляют поведением стволовых клеток, сигнальные пути, которые преобразуют эти силы, и как эти знания формируют следующее поколение стратегий восстановления костей.

Роль механических стимулов в регенерации костей

Кость — это динамическая ткань, которая постоянно адаптируется к своей механической среде, принципу, известному как закон Вольфа. Механическая нагрузка — будь то ежедневная ходьба, тренировка веса или даже микрогравитация в пространстве — напрямую влияет на ремоделирование костей. В тканевой инженерии репликация этих сил имеет важное значение, потому что стволовые клетки, культивируемые в статических условиях, часто не созревают в прочные костообразующие клетки. Механические стимулы имитируют естественную физиологическую среду, способствуя остеогенной дифференцировке и минерализации матрицы. Например, было показано, что циклическое сжатие при умеренных величинах усиливает экспрессию остеопонтина и костного сиалопротеина в мезенхимальных стволовых клетках (МСК), засеянных на каркасных лесах. Величина, частота и продолжительность механической нагрузки должны быть тщательно откалиброваны: слишком мало силы не может вызвать реакцию, в то время как чрезмерная сила может привести к гибели клеток или нежелательной дифференцировке в

Источники стволовых клеток для Bone Tissue Engineering

В костной инженерии используется несколько типов стволовых клеток, каждый из которых имеет различные механочувствительные профили. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из костного мозга или жировой ткани, являются наиболее распространенными из-за их мультипотентности и легкости изоляции. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) обладают неограниченным потенциалом расширения и могут быть специфичными для пациента, но их механобиология менее характерна. Эмбриональные стволовые клетки являются мощными, но сталкиваются с этическими и регуляторными препятствиями. Важно отметить, что механическая среда может влиять не только на дифференцировку, но и на пролиферацию клеток и выживаемость. Например, МСК, подверженные циклическому напряжению, демонстрируют повышенную экспрессию интегранов, рецепторов клеточной поверхности, которые прикрепляют клетки к внеклеточному матриксу (ЭКМ) и передают механические сигналы в клетку. Понимание механосенситивности различных источников стволовых клеток является ключом к проектированию каркасов и биореакторов, которые максим

Виды механических стимулов и их влияние

Механические стимулы можно разделить на три основных способа: сжатие, растяжение и напряжение сдвига жидкости. Каждый оказывает различное влияние на поведение стволовых клеток, и их объединение часто дает синергетические результаты.

Сжатие

Сжимающие силы имитируют несущие нагрузку функции кости, особенно в несущих вес областях, таких как бедренная кость и позвонки. In vitro циклическая сжимающая нагрузка МСК, инкапсулированных в гидрогелевых каркасах, усиливает остеогенные гены, такие как RUNX2 и Osterix. Сжатие также стимулирует высвобождение растворимых факторов, таких как простагландин Е2, который может действовать паракринным образом для усиления образования костей. Исследования с использованием поликапролактона-трикальциевых фосфатных каркасов, подвергающихся 10-процентному напряжению при 1 Гц в течение 1 часа в день, показали 2,5-кратное увеличение объема кости по сравнению с незагруженными элементами управления в модели черепного дефекта крыс in vivo. Однако сжатие должно применяться таким образом, чтобы избежать повреждения архитектуры каркаса или вызвать чрезмерную гибель клеток.

напряженность

Растяжение (растяжение) испытывается костью во время прикрепления мышц и во время движений изгиба, когда одна сторона кости испытывает напряжение. Этот стимул особенно эффективен при ориентации клеток и коллагеновых волокон по оси деформации, улучшая анизотропные механические свойства инженерной кости. Эксперименты in vitro с МСК, культивируемыми на коллаген-GAG каркасах и подвергаемыми 8% циклическому растяжению деформации при 0,5 Гц показали увеличение осаждения коллагена I типа и улучшение выравнивания. Напряжение также активирует сигнальный путь ERK1/2, который способствует прогрессированию клеточного цикла и производству матрицы. Одна проблема с напряжением заключается в том, что чрезмерное напряжение может привести к отслоению или разрыву клеток; поэтому оптимальные параметры варьируются в зависимости от материала каркаса и типа клетки.

Стресс стрижка

Стресс сдвига жидкости (FSS) возникает из потока интерстициальной жидкости через лакунарно-каналикулярную сеть кости, генерируемую во время механической нагрузки. В биореакторах FSS можно применять через перфузию культуральной среды через пористые каркасы. Стресс сдвига является мощным остеогенным стимулом, в основном потому, что он активирует механочувствительные ионные каналы (например, Piezo1) и первичные реснички на поверхности клетки. Было показано, что скорость потока перфузии 0,1-1 мл / мин увеличивает экспрессию костного морфогенетического белка 2 (BMP-2) и остеокальцина в МСК в 4 раза по сравнению со статической культурой. Сдвига также усиливает массовый транспорт питательных веществ и кислорода, что имеет решающее значение для толстых конструкций, которые в противном случае страдают от ограничений диффузии. Было обнаружено, что сочетание напряжения сдвига с компрессией оказывает аддитивное воздействие на минерализацию матрицы.

Пути механотрансдукции

Механотрансдукция — это процесс, посредством которого клетки преобразуют физические силы в биохимические сигналы.Несколько взаимосвязанных путей опосредуют дифференцировку стволовых клеток в ответ на механические раздражители.

Wnt/β-катенин сигнализация

Механическая нагрузка стабилизирует β-катенин, позволяя его транслокации в ядро, где он сотрудничает с факторами транскрипции TCF / LEF для стимулирования остеогенной экспрессии генов. Было показано, что циклическое сжатие повышает регуляцию Wnt3a и LRP5, сорецептора для лигандов Wnt. Мутации в LRP5 связаны с нарушениями плотности костной ткани, подчеркивая важность пути. В тканевой инженерии каркасы, включающие агонисты Wnt, могут синергирировать с механической нагрузкой для ускорения остеогенеза.

MAPK/ERK Сигналы

Каскад митоген-активированной протеинкиназы (MAPK), в частности ERK1/2, быстро активируется механическими силами. Стресс и напряжение сдвига стимулируют кластеризацию интегрина и фокальное адгезионное киназное (FAK) фосфорилирование, которое в свою очередь активирует ERK. ERK фосфорилаты runx2, повышая его транскрипционную активность. Кроме того, p38 MAPK участвует в раннем ответе на нагрузку, регулируя экспрессию остеогенных маркеров, таких как коллаген типа I. Фармакологическое ингибирование ERK устраняет компрессионно-индуцированный остеогенез в МСК.

Rho/ROCK сигнализация

RhoA и его эффектор ROCK регулируют динамику актина цитоскелета и сократимость клеток. Механические стимулы активируют RhoA, приводя к образованию стрессовых волокон и изменениям формы клеток. Эти цитоскелетные изменения влияют на локализацию транскрипционных коактиваторов, таких как YAP/TAZ. Например, в клетках, подвергающихся низкому сдвигающему стрессу, YAP/TAZ остаются в цитоплазме, способствуя пролиферации; при высоком сдвига они транслоцируются в ядро и приводят к остеогенной экспрессии генов. Путь Rho/ROCK также взаимодействует с сигнализацией Wnt, добавляя еще один слой регуляции.

Сигналы кальция и первичная цилия

Механические стимулы могут открывать кальций-проницаемые ионные каналы (например, TRPV4, Piezo1), приводя к внутриклеточным переходным процессам кальция. Эти кальциевые шипы активируют киназы, которые усиливают остеогенную транскрипцию. Первичные реснички — органеллы на основе микротрубочек, реагирующие на поток жидкости — действуют как механосенсоры, изгибаясь под силами сдвига. Нарушение первичных ресничек ухудшает остеогенный ответ на FSS. Сигнализация кальция также связывается с оксидом азота и простагландиновыми путями, которые способствуют анаболизму костей.

Биореакторы и конструкция каркаса для механического кондиционирования

Для перевода принципов механической стимуляции в практическую тканевую инженерию требуются биореакторы, способные доставлять контролируемые, воспроизводимые силы на клеточные эшафот. Разработано несколько конструкций биореакторов:

  • Биореакторы сжатия: Используют поршень или пластину для применения циклического или статического сжатия. Современные конструкции включают нагрузочные ячейки для точного управления величиной и частотой силы, что позволяет обеспечить точность миллиневтона.
  • Биореакторы перфузии: Обрабатывают культуральную среду через поры каркаса, создавая нагрузку на сдвига жидкости. Они также усиливают массовый транспорт, критически важный для более крупных конструкций (>5 мм толщиной).
  • Десятильные биореакторы: Растягивают каркасы одноосно или двуосно. Они менее распространены для костей, но используются в сухожилиях и связках.
  • Многомодальные биореакторы: Комбинируют сжатие и перфузию, чтобы более точно имитировать сложную механическую среду кости. Такие системы показали синергетическое увеличение объема кости и модуля сжатия.

Не менее важна конструкция каркаса. Механические силы передаются к клеткам через ECM или каркасный материал. Идеальные каркасы для механической стимуляции пористые (для обеспечения потока жидкости), биосовместимые и обладают механическими свойствами, которые соответствуют нативной кости (компрессивный модуль 1-20 ГПа). Обычно используются синтетические полимеры (например, PLGA, PCL) и природные материалы (например, коллаген, гидроксиапатит). Включение микро- и нанотопографических сигналов может усиливать механотрансдукцию путем усиления кластеризации интегрина. Например, нанопаттерны, которые имитируют выравнивание фибрилл коллагена, могут увеличить экспрессию остеогенных маркеров в 3 раза при циклическом напряжении по сравнению с плоскими поверхностями.

В Vitro vs. В Vivo приложения

Механическая стимуляция in vitro была широко изучена, но перевод этих парадигм в in vivo или клинические условия остается сложной задачей. Предварительное кондиционирование каркасов в биореакторе до имплантации может создать более зрелую, механически надежную конструкцию. В модели дефекта овец, MSC, посаженные на каркасах коллаген-гидроксиапатита и предварительно загруженные циклическим сжатием в течение 3 недель, достигли 85% костного союза на 12 неделе, по сравнению с 50% в незагруженных элементах управления. Однако механическая среда in vivo более сложна, с динамическими нагрузками от движения и веса. Некоторые исследователи изучают использование резорбируемых фиксационных устройств, которые обеспечивают начальную механическую стимуляцию по мере интеграции каркаса. Другой подход заключается в включении магнитно-чувствительных наночастиц в каркасы, что позволяет неинвазивное применение механических сил внешним магнитным полем.

Последствия для инженерии костной ткани

Механические стимулы являются не просто дополнительным фактором, но и основным регулятором дифференциации стволовых клеток в костной ткани. Интегрируя оптимизированную механическую нагрузку в конструкцию каркаса и культуру биореактора, исследователи добились значительных улучшений в формировании костей - до 5-кратного увеличения объема костей и 2-кратного улучшения механической прочности по сравнению со статическими культурами. Эти достижения имеют прямые клинические последствия для лечения сегментарных дефектов костей (например, от травмы или резекции опухоли), непрофсоюзных переломов и остеопоротических переломов. Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента в сочетании с механическим кондиционированием может позволить персонализированные костные трансплантаты, которые соответствуют механическим требованиям места дефекта.

Будущие направления и вызовы

Несмотря на обещание, остаются несколько препятствий. Стандартизация механических параметров на различных материалах каркаса и типах клеток сложна — протокол, который работает для МСК на каркасе PLGA, может быть не оптимальным для iPSC на гидрогеле коллагена. Конструкции биореакторов должны учитывать форму и размер конструкций клинического масштаба (например, целые сегменты бедра). Механизмы механической трансдукции, такие как с участием микроРНК или экзосом, все еще выясняются; Механизмы механической трансдукции, такие как те, которые связаны с микроРНК или экзосомами, могут играть значительную роль. Поскольку механическая нагрузка также может способствовать адипогенезу или хондрогенезу при определенных условиях, контроль специфичности дифференциации имеет решающее значение. Будущие исследования, вероятно, будут сосредоточены на интеграции вычислительного моделирования (анализ конечных элементов) для прогнозирования клеточных реакций на сложные режимы загрузки и на разработке интеллектуальных каркасов, которые выделяют остеогенные факторы в ответ на механический стресс. Подходы персонализированной медицины, где плотность костной ткани пациента

В заключение, механические стимулы необходимы для направления дифференциации стволовых клеток в костной ткани инженерии. Воспроизведя естественные силы, которые испытывают кости, исследователи могут улучшить формирование функциональной, механически компетентной кости. Продолжение достижений в технологии биореакторов, конструкции каркаса и наше понимание механотрансдукции проложит путь для клинического перевода. С тщательной оптимизацией, механически обусловленные конструкции стволовых клеток могут вскоре стать стандартной терапией для регенерации костей, предлагая новую надежду для пациентов с тяжелыми дефектами кости. Для дальнейшего чтения см. Обзор по механотрансдукции в кости Klein-Nulend et al., , исследование по циклическому сжатию МСК в шелковых каркасах Hofmann et al. и работа по перфузионным биореакторам для костной инженерии Grayson et al. .