Диагностические инструменты на основе Crispr для инфекционных заболеваний

Инфекционные заболевания продолжают представлять серьезную угрозу для глобального общественного здравоохранения, унося миллионы жизней каждый год и создавая огромную нагрузку на системы здравоохранения. Быстрая и точная диагностика является краеугольным камнем эффективного контроля заболеваний, однако многие существующие методы диагностики остаются недоступными в условиях с низкими ресурсами, где вспышки часто наиболее сильно поражают. В последние годы из мира молекулярной биологии появился неожиданный союзник: система CRISPR. Известная своей ролью в редактировании генома, CRISPR была перепрофилирована в мощную диагностическую платформу, способную обнаруживать патогены с беспрецедентной скоростью, специфичностью и доступностью. Эти диагностические инструменты на основе CRISPR трансформируют ландшафт обнаружения инфекционных заболеваний, предлагая заглянуть в будущее, где тестирование не только быстрее и надежнее, но и развертывается в любой точке мира.

Происхождение диагностической технологии CRISPR

Чтобы понять, как CRISPR стал диагностическим инструментом, он помогает пересмотреть его естественную функцию. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это бактериальная иммунная система, которая запоминает и уничтожает вторгающиеся вирусы, нацеливаясь на их генетический материал. Ученые сначала использовали эту систему для редактирования генов, но вскоре поняли, что тот же программируемый механизм нацеливания может быть использован для обнаружения конкретных последовательностей нуклеиновых кислот от патогенов. В сочетании с молекулой репортера событие связывания запускает обнаруживаемый сигнал — эффективно превращая систему CRISPR в датчик.

Прорыв произошел в 2017 году, когда две исследовательские группы независимо разработали диагностические платформы на основе CRISPR. Система SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) , разработанная в Институте Броуда, использует Cas13a, фермент, который расщепляет РНК после связывания с ее мишенью. Система DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter), разработанная в Калифорнийском университете в Беркли, использует Cas12a, которая нацелена на ДНК. Обе системы производят флуоресцентный или колориметрический сигнал в присутствии генетического материала патогена, что позволяет обнаруживать в аттомолярных концентрациях.

Эти платформы представляли собой сдвиг парадигмы. Традиционные молекулярные тесты, такие как ПЦР, требуют дорогостоящих термоциклеров, обученного персонала и часов времени обработки. Диагностика на основе CRISPR, напротив, может функционировать при одной температуре (изотермическое усиление) и генерировать результаты менее чем за час без сложного оборудования. Их модульная конструкция означает, что направляющая РНК может быть быстро перепрограммирована для нацеливания на любую новую последовательность патогенов - гибкость, которая оказалась бесценной во время пандемии COVID-19.

Как работает диагностика CRISPR: пошаговый взгляд

Хотя детали различаются по платформам, вся диагностика на основе CRISPR имеет общий рабочий процесс, построенный вокруг трех основных этапов: подготовка образцов, усиление цели и обнаружение с помощью CRISPR. Понимание этих шагов проливает свет на то, почему технология настолько эффективна и адаптируема.

Шаг 1: Подготовка образцов и экстракция нуклеиновой кислоты

Первый шаг включает в себя сбор образца у пациента, такого как назальный тампон, слюна, кровь или моча, и извлечение его нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). Этот шаг аналогичен обычному молекулярному тестированию и может быть выполнен с использованием простых, коммерчески доступных наборов. Текущие инновации, включая методы лизиса на основе тепла и извлечение на основе бумаги, направлены на упрощение этого процесса для настроек пункта ухода.

Шаг 2: Изотермическая амплификации

Вместо теплового цикла, требуемого ПЦР, в диагностике CRISPR обычно используются методы изотермического усиления, такие как амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) или изотермическое усиление с петлевой опосредованностью (LAMP). Эти методы усиливают целевую нуклеиновую кислоту при постоянной температуре (обычно между 37 ° C и 65 ° C), устраняя необходимость в термоциклере. Амплифицированный материал обеспечивает достаточное количество целевых последовательностей для распознавания машинами CRISPR.

Шаг 3: CRISPR-срединное обнаружение

Ядро диагностической реакции объединяет амплифицированную мишень, направляющую РНК (gRNA), предназначенную для связывания целевой последовательности, и эффекторный фермент CRISPR (Cas12a, Cas13a или Cas14). Когда гРНК идеально связывается с соответствующей ей ДНК или РНК-мишенью, фермент Cas активируется. В отличие от Cas9, который просто режет целевую ДНК, эти ферменты Cas проявляют коллатеральную (неспецифическую) активность расщепления. Они начинают разрезать близлежащие одноцепочечные нуклеиновые кислоты без разбора. Для диагностических целей реакция включает в себя закаленный флуоресцентный репортер — короткую одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, меченную флуорофором и гашением. Активированный фермент Cas расщепляет эти репортерные молекулы, высвобождая флуорофор и производя обнаруживаемый флуоресцентный сигнал.

Шаг 4: Прочтение сигнала

Увеличение флуоресценции можно измерить с помощью простого считывателя пластин, переносного флюорометра или даже камеры смартфона с внешним креплением. Некоторые платформы были адаптированы для получения изменения цвета, видимого невооруженным глазом, или для генерации электрического сигнала, обнаруженного портативным устройством. Интенсивность сигнала коррелирует с количеством присутствующей целевой нуклеиновой кислоты, что позволяет получить как качественные (положительные/отрицательные) так и полуколичественные результаты в течение 30-60 минут после сбора образца.

Основные преимущества традиционных методов диагностики

Диагностика на основе CRISPR предлагает ряд преимуществ, которые устраняют многие ограничения, присущие современным методам тестирования. Хотя ни один тест не идеален, платформы CRISPR обеспечивают баланс между производительностью, стоимостью и доступностью, что делает их уникальными для глобальных применений в области здравоохранения.

• Скорость. Традиционное ПЦР-тестирование, от сбора образцов до результата, часто занимает 2-4 часа в централизованной лаборатории. Диагностика CRISPR дает результаты менее чем за один час, а некоторые платформы могут производить считывание всего за 20 минут. Этот быстрый поворот имеет решающее значение для контроля заражения во время вспышек, позволяя принимать решения о диагностике и лечении с одинаковым визитом.
• Высокая специфичность.] Руководящая РНК спроектирована так, чтобы соответствовать только уникальной последовательности от целевого патогена. Внецелевое связывание встречается редко, а активность коллатерального расщепления дополнительно усиливает специфичность. Результатом является ложноположительная скорость, сопоставимая или лучше, чем ПЦР, что делает диагностику CRISPR высоконадежной в клинических условиях.
• Низкая стоимость. Поскольку изотермическая амплификация устраняет необходимость в термоциклере, и поскольку реагенты (полимераза Така, пользовательские праймеры, ферменты Каса) становятся все более доступными, стоимость тестирования может быть низкой, как несколько долларов. По мере увеличения масштабов производства и оптимизации протоколов, ожидается, что затраты упадут еще больше, потенциально в ценовой диапазон быстрых тестов на антиген при сохранении точности ПЦР.
• Портативность и пригодность к месту ухода.] Оборудование, необходимое для диагностики CRISPR, может поместиться в небольшой рюкзак. Некоторые группы разработали бумажные тест-полоски, которые отображают результаты, такие как домашний тест на беременность. Другие интегрировали реакцию в микрофлюидные чипы, контролируемые смартфоном. Эти черты делают технологию идеальной для развертывания в сельских клиниках, аэропортах, пограничных переходах и других ограниченных ресурсами средах, где лабораторная инфраструктура недоступна.
• Программируемость.] Руководящая РНК представляет собой короткую синтетическую молекулу, которая может быть разработана и упорядочена в сутках. Когда появляется новый патоген — или когда возникает вариант — диагностический тест может быть быстро обновлен для нацеливания на новую последовательность. Эта адаптивность была продемонстрирована во время пандемии COVID-19, когда исследователи разработали анализы SHERLOCK и DETECTR для SARS-CoV-2 в течение недель после публикации геномной последовательности.

Чтобы представить это в перспективе, обзор Всемирной организации здравоохранения 2022 года диагностических технологий CRISPR подчеркнул, что многие платформы соответствуют критериям ASSURED (доступные, чувствительные, специфические, удобные для пользователя, быстрые и надежные, без оборудования, доставляемые для конечных пользователей), установленным для тестов в пунктах обслуживания, помещая их в уникальную категорию, которая устраняет разрыв между лабораторными молекулярными тестами и быстрыми тестами на антиген.

Основные диагностические платформы CRISPR

С момента первоначального описания SHERLOCK и DETECTR, область взорвалась инновациями. Каждая платформа использует различные ферменты Cas и механизм считывания, предлагая различные компромиссы в чувствительности, скорости и простоте. Понимание основных платформ дает представление о широте технологии.

SHERLOCK (Cas13)

Платформа SHERLOCK, разработанная группой Фэн Чжана в Институте Брода, использует фермент Cas13, который нацелен на РНК. Поскольку многие патогены, включая SARS-CoV-2, грипп и ВИЧ, имеют РНК-геномы, SHERLOCK особенно хорошо подходит для обнаружения этих вирусов. Оригинальный SHERLOCK достиг аттомолярной чувствительности, но требовал отдельных этапов амплификации и обнаружения. Более поздняя версия, SHERLOCKv2, интегрировала эти этапы и включила считывание бокового потока, что позволило визуализировать результаты на бумажной полоске — так же, как тест на беременность. SHERLOCK также был мультиплексирован для обнаружения до четырех различных целей в одной реакции, открывая дверь для синдромных панелей, которые могут одновременно тестировать на множественные патогены, вызывающие подобные симптомы (например, COVID-19 против гриппа против RSV).

DETECTR (Cas12-based)

Разработанная группой Дженнифер Дудны в Калифорнийском университете в Беркли, система DETECTR использует Cas12a, фермент, который нацелен на двухцепочечную ДНК. Для РНК-вирусов РНК должна быть сначала обратно транскрибирована в ДНК — простой шаг с использованием коммерчески доступных ферментов. DETECTR был одним из первых диагностических средств CRISPR, получивших разрешение на экстренное использование от FDA США во время пандемии COVID-19. Он продемонстрировал 95% чувствительность и специфичность 98% по сравнению с ПЦР в клинических образцах, и весь рабочий процесс от образца к результату занял около 45 минут. DETECTR с тех пор был адаптирован для обнаружения других патогенов, включая ВПЧ (вирус папилломы человека) и малярийных паразитов.

Cas12b, Cas14 и другие

Исследователи расширили набор инструментов CRISPR с помощью ферментов, которые предлагают уникальные преимущества. Cas12b (первоначально от термофильной бактерии) работает при более высоких температурах, снижая риск неспецифического фонового расщепления. Cas14 нацелен на одноцепочечные ДНК и используется для генотипирования приложений, включая обнаружение мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью. Cas3 , фермент CRISPR класса I, производит более устойчивый каскад расщепления, потенциально улучшая усиление сигнала. Все же другие группы изучают использование систем CRISPR-Cas без коллатерального расщепления , вместо этого используя события связывания для запуска изменений электрической проводимости на чипе, прокладывая путь для обнаружения в режиме реального времени без меток.

Клинические применения: от пандемического ответа до эндемических заболеваний

Диагностика CRISPR уже была развернута в клинических исследованиях для ряда инфекционных заболеваний, демонстрируя реальную полезность за пределами академической работы.

COVID-19

Пандемия COVID-19 послужила катализатором диагностики CRISPR. И SHERLOCK, и DETECTR были быстро адаптированы для обнаружения SARS-CoV-2 и проверены в клинических условиях. Одно заметное исследование, опубликованное в Nature Biotechnology, сообщило, что тест на основе DETECTR на 330 клинических образцах достиг 100% положительного прогнозного соглашения и 98,5% отрицательного прогнозного соглашения с PCR. Тест не требовал специализированного оборудования за пределами теплового блока и простого трансиллюминатора синего света. Несколько компаний, включая Mammoth Biosciences (соучредитель Дженнифер Дудна) и Sherlock Biosciences, коммерциализировали эти тесты и получили одобрение регулирующих органов в нескольких странах. Опыт ускорил масштабирование производства и проложил путь для принятия диагностики CRISPR в обычном надзоре за общественным здравоохранением.