Достижения в области микробной ферментации для производства сложных природных продуктов

Оригинальное название: The Renaissance of Microbial Fermentation

Микробная ферментация была краеугольным камнем биотехнологии более века, от производства пенициллина в 1940-х годах до современного производства ферментов, биотоплива и ароматических соединений. Однако в последние годы сближение прорывов в синтетической биологии, метаболической инженерии и машинном обучении привело к сближению сложных природных продуктов, которые когда-то считались безнадёжно недоступными для промышленной микробиологии. Эти соединения, часто характеризующиеся сложными полициклическими структурами, стереохимической точностью и редкими функциональными группами, необходимы для медицины (противораковые агенты, иммунодепрессанты, антиинфекционные средства), сельского хозяйства (биопестициды, промоторы роста) и специальных химических веществ (парфюмерии), а традиционный химический синтез таких молекул часто непрактичен из-за низких урожаев, суровых условий или непомерных затрат, в то время как извлечение из природных источников — растений, губок или редких микроорганизмов — неустойчиво и часто экологически вредно. Следовательно, способность программировать микроорганизмы для производства этих молекул в биореакторах представляет собой преобраз

В этой статье рассматриваются наиболее значительные достижения, способствующие этому возрождению, рассматриваются ключевые технологии, обеспечивающие возможность, и освещается растущий репертуар сложных природных продуктов, доступных в настоящее время благодаря микробной ферментации. В ней также обсуждаются инженерные проблемы, которые сохраняются, появление подходов без клеток и in situ и путь вперед по мере созревания области от академического доказательства концепции до коммерческой реальности.

Исторический контекст и современная платформа ферментации

Прежде чем углубляться в последние инновации, полезно понять эволюцию микробной ферментации для натуральных продуктов. Первый рекомбинантный белок, продуцируемый в Escherichia coli ] ] ] [[PKS]] [[PKS]] [[PKS

Современная платформа ферментации объединяет четыре столпа:

  • Диверсификация хозяев : расширение палитры хозяев продукции за пределы E. coli и дрожжей, включая актиномицеты, нитевидные грибы и даже клетки млекопитающих.
  • Геномайнинг: использование биоинформатики для обнаружения тихих или загадочных биосинтетических кластеров генов (BGC) из ДНК и метагеномов окружающей среды.
  • Путь рефакторинга: переписывание генетической архитектуры BGCs для разъединения регуляции, усиления экспрессии и устранения ингибирования обратной связи.
  • Интенсификация процессов : объединение ферментации кормовой партии с удалением продукта in situ, непрерывным кормлением и аналитикой в реальном времени для максимизации объемной производительности.

Эти элементы вместе позволяют производить сложные натуральные продукты в масштабах от миллиграммов для клинических испытаний до метрических тонн для химических веществ.

Генная инженерия: от рефакторинга генных кластеров до проектирования с поддержкой CRISPR

CRISPR-Cas9 и далее: точное редактирование биосинтетических путей

Появление CRISPR-Cas9 трансформировало скорость и область микробной деформации. Для сложных натуральных продуктов основной задачей часто является не введение гетерогенных генов, а оптимизация их экспрессии в новом хозяине. Инструменты CRISPR позволяют исследователям:

  • Вставить целые BGC в конкретные геномные локусы со стабильной интеграцией.
  • Выключить конкурирующие метаболические пути для перенаправления потока углерода в продукт.
  • Внедрить направленные мутации в ферментах, ограничивающих скорость, для повышения каталитической эффективности или специфичности субстрата.
  • Создать мультиплексные библиотеки регуляторных вариантов (
    • ]
Например, производство эритромициновых аналогов

Метаболическая оптимизация пути и модульная инженерия

Помимо редактирования генов, оптимизация метаболических путей использует системную биологию и синтетическую биологию для создания надежных путей с высоким потоком.

  • Динамическая регуляция: создание биосенсоров, которые контролируют экспрессию генов в ответ на концентрации метаболитов, предотвращая накопление токсичных промежуточных продуктов.
  • Расклады : совместное размещение ферментов через синтетические белковые каркасы для направления промежуточных соединений и уменьшения потерь из-за диффузии.
  • Компартментализация: инжиниринг производства в органеллы (например, пероксисомы в дрожжах) для отделения биосинтетических стадий от конкурирующих клеточных процессов.
  • Кофакторная инженерия: балансировка NADPH, ATP и других кофакторов для поддержки энергоемкого биосинтеза.

Знаковым примером является производство опиумных алкалоидов (морфин, кодеин)] в инженерных дрожжах, которые требовали сборки более 20 гетерологичных ферментов из растений, бактерий и дрожжей. Модульно оптимизируя каждый из четырех промежуточных сегментов — шикиматный путь, ветвь ретикулина, путь морфина и преобразование тебаина в морфин — исследователи впервые достигли миллиграмма на литр титроцитов в микробном хозяине. Эта работа, опубликованная в Природная химическая биология , иллюстрирует, как модульная инженерия путей может справиться с чрезвычайной молекулярной сложностью.

Передовые хозяева ферментации: за пределами E. coli и S. cerevisiae

Хотя E. coli и пекарские дрожжи остаются основными продуктами, они не всегда являются лучшим выбором для сложных натуральных продуктов. Многие поликетиды и нерибосомные пептиды требуют посттрансляционных модификаций (гликозилирование, гидроксилирование, метилирование), которые отсутствуют у прокариот. Следовательно, область охватила растущий портфель хозяев продукции:

  • Стрептомики: первоначальный источник многих антибиотиков, эти актиномицеты обладают надежными системами PKS типа I и типа II и, естественно, обладают навыками получения сложных метаболитов.Недавние достижения в клонировании рекомбинации, связанной с трансформацией (TAR) позволяют сначала собирать целые Стрептомики BGC в дрожжах, а затем передавать в Стрептомики для экспрессии.
  • Филаментные грибы (например, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum): отлично подходят для получения грибковых поликетидов и нерибосомальных пептидов, с хорошо развитыми гомологичными системами рекомбинации и секреции.
  • Pichia pastoris (Komagataella phaffii): метилотрофные дрожжи, которые растут до высокой плотности клеток на метаноле и все чаще используются для производства растительных терпеноидов, таких как противомалярийная артемизиновая кислота.
  • Cellulomonas и Bacillus виды: исследуются для производства антимикробных пептидов и антибиотиков с пониженным образованием побочных продуктов.
  • Родококк и Псевдомоны : исследованы на их способность обрабатывать токсичные промежуточные продукты и метаболизировать дешевое сырье, такое как лигнин или пластмассы.

Каждый хозяин обладает уникальными возможностями — Стрептомикаты для комплексной циклизации, грибы для окислительных модификаций и Пичиа для ферментаций высокой плотности, — но также и уникальными проблемами: более медленный рост, меньше генетических инструментов и более низкая эффективность трансформации. Выбор хозяина должен быть обусловлен конкретными требованиями целевого соединения, особенно его молекулярной массой, функциональной групповой ответственностью и наличием нативных или инженерных посттрансляционных механизмов.

Применение: новое поколение сложных природных продуктов

Комплексные антибиотики: Воскресение Золотого Века

Антибиотический кризис вызвал возобновление интереса к производству малоизвестных природных антибиотиков, которые были оставлены в 1950-70-х годах, потому что их было слишком трудно синтезировать или извлечь. Микробная ферментация теперь предлагает путь для возрождения этих молекул. Примеры включают:

  • Даптомицин: циклический липопептидный антибиотик, применяемый против резистентных грамположительных патогенов. Коммерческое производство основано на ферментации Стрептомицес розовоспорус, но недавняя метаболическая инженерия удвоила титры до >1 г/л.
  • Тейксобактин: недавно обнаруженный депсипептид, убивающий Mycobacterium tuberculosis и MRSA без обнаруживаемой резистентности. Гетерологичная продукция в E. coli была достигнута путем рефакторинга его BGC, обеспечивая достаточный материал для доклинических исследований.
  • Моэномицин А: фосфогликолипидный антибиотик, ингибирующий синтез бактериальной клеточной стенки. Его очень сложная структура (>40 хиральных центров) сделала невозможным химический синтез; микробная ферментация в сконструированных Стрептомицес является единственным жизнеспособным способом производства.

Кроме того, комбинаторный биосинтез — смешивание и сопоставление кластеров генов — может генерировать тысячи аналогов, от новых к естественным. Например, замена доменов ацилтрансфераз модулей PKS дала десятки новых производных эритромицина с улучшенными фармакологическими свойствами.

Противораковые агенты: от корней растений до биореакторов

Некоторые из наиболее мощных противораковых соединений являются вторичными метаболитами растительного происхождения. Микробная ферментация теперь обеспечивает масштабируемый доступ к этим молекулам:

  • Паклитаксел (Taxol): первоначально извлекался из коры тихоокеанского тисового дерева. Биосинтетический путь был частично восстановлен в E. coli и дрожжах, при этом продолжается производство ключевого промежуточного таксадиена при >1 г/л. Усилия по экспрессии последующих этапов гидроксилирования и ацилирования.
  • Винбластин и винкристин: димерные индоловые алкалоиды из Catharanthus roseus.В 2022 году команда сообщила о полном биосинтезе предшественника катарантина в дрожжах, что ознаменовало собой веху на пути к полному биосинтезу.
  • Галихондрин B: макролид полиэфира из морских губок с пикомолярной антипролиферативной активностью.Его синтетический аналоговый эрибулин (Галавен) является блокбастерным препаратом, но натуральный продукт требует десятков синтетических стадий.Микробная ферментация галогендрина B в сконструированной E. coli достигнута путем экспрессии 47-генного кластера, хотя титры остаются низкими.

Биоактивные природные продукты для сельского хозяйства и промышленности

Платформа ферментации также поддерживает производство натуральных продуктов, которые служат пестицидами, гербицидами и промышленными ферментами.

  • Спинозины: макроциклические лактоны, продуцируемые Сахарополизпорой спинозы. Титры ферментации были улучшены классическим мутагенезом и целевыми нокаутами генов, что делает спинозин ведущим биопестицидом.
  • Авермектины: антелминтические агенты, используемые в ветеринарии и медицине человека.Открытие авермектина BGC в Streptomyces avermitilis привело к его производству путем ферментации, и последующая инженерия создала полусинтетический аналог ивермектин.
  • Светоотражающий люциферин и аналоги : биолюминесцентные соединения, требующие сложной гетероциклической химии. Разработка стабильного штамма E. coli для производства люциферина позволила провести недорогой, возобновляемый синтез для исследований и диагностических анализов.

Будущие перспективы: машинное обучение, системы без клеток и непрерывная ферментация

Машинное обучение для проектирования и оптимизации Pathway

Сложность микробного метаболизма — с сотнями ферментов, тысячами метаболитов и нелинейными взаимодействиями — делает традиционную разработку проб и ошибок медленной и дорогой. Модели машинного обучения (ML) все чаще используются для прогнозирования эффектов генетических модификаций, оптимизации состава среды и даже проектирования синтетических путей. Например, исследователи обучили нейронные сети на метаболических моделях геномного масштаба, чтобы предсказать, какие генные нокауты увеличивают поток к целевому продукту. В исследовании 2023 года дизайн промотора с ML-наведением увеличил титр нерибосомного пептидного поверхностно-активина в 6 раз в Бациллус субтилиз . Аналогично, обучение с подкреплением использовалось для автономного управления ферментацией с кормом, регулировки скорости подачи и растворенного кислорода для максимизации объемной производительности в реальном времени.

Системы без клеток: разблокировка невозможной химии

Безклеточная метаболическая инженерия (CFME) предлагает альтернативу живой ферментации для самых сложных натуральных продуктов. Лизинг клеток и использование полученного сырого экстракта - или очищенных ферментов - реакции происходят без клеточных стенок, мембран или требований роста. Этот подход особенно привлекателен для:

  • Соединения, которые токсичны для живых клеток (например, многие аналоги противораковых жирных кислот).
  • Пути со многими неродными кофакторами или окислительно-восстановительными балансами, которые трудно достичь in vivo .
  • Быстрое прототипирование вариантов пути (время обхода часов вместо недель).

Системы без клеток использовались для производства каннабиноидов, опиоидов и даже сложного макролида пикромицина. Однако масштабируемость остается серьезной проблемой: кормление АТФ и НАДФН является дорогостоящим, а ферменты со временем деградируют. Достижения в регенерации кофакторов (например, с использованием полифосфаткиназы) и иммобилизации ферментов начинают устранять эти ограничения, и бесклеточная ферментация может стать жизнеспособным промышленным методом для высокоценных, малообъемных натуральных продуктов.

Непрерывная ферментация и восстановление продукта в условиях

Традиционная пакетная ферментация страдает от высокого простоя и непоследовательного качества продукта. Непрерывная ферментация - где добавляются свежие среды и отвар удаляется одновременно - использовалась в течение десятилетий для первичных метаболитов, таких как этанол, но менее распространена для сложных вторичных метаболитов из-за генетического дрейфа, чувствительности к сдвигу и риска загрязнения. Тем не менее, несколько недавних достижений в непрерывной конструкции биореактора , такие как перфузионные культуры с удержанием клеток (с использованием мембран полых волокон или акустических поселенцев), позволили производить лабильные натуральные продукты. В сочетании с адсорбцией in situ (например, на смолах XAD) или двухфазным разделением (например, с использованием ионных жидкостей), продукт может быть удален до того, как он ухудшает или ингибирует рост клеток. Эти интегрированные биопроцессы особенно перспективны для увеличения сложных противораковых агентов и антибиотиков, которые нестабильны в водных средах.

Проблемы и барьеры для коммерциализации

Несмотря на эти замечательные достижения, остаются значительные препятствия, прежде чем многие из этих инженерных микробов станут промышленными рабочими лошадками.

  • Титр, выход и производительность часто слишком низки: для сложных натуральных продуктов (MW > 1000 да) титры в диапазоне микрограмм на литр являются общими, тогда как коммерческая жизнеспособность обычно требует > 1 г / л. Для преодоления этого разрыва требуется одновременное оптимизация нескольких шагов пути, физиология хоста и обработка вверх по течению.
  • Генетическая нестабильность: BGC часто имеют мегабазовый размер и могут быть потеряны или заглушены после многих поколений, особенно в непрерывной культуре. Инженерная интеграция в геном и использование маркеров отбора могут смягчить это, но не устранить.
  • Расходы на обработку по нисходящей линии : Добыча и очистка гидрофильных, заряженных или лабильных натуральных продуктов из ферментационного бульона может быть более дорогостоящей, чем сама ферментация. Достижения в восстановлении продукта * in situ* (например, с использованием двухфазных биореакторов для разделения) помогают, но по-прежнему необходимы надежные, экономически эффективные поезда очистки.
  • Регуляторный ландшафт и ландшафт интеллектуальной собственности: Природные продукты часто патентуются десятилетия назад, и новые производственные маршруты могут нарушать требования о составе вещества. Кроме того, если спроектированный организм является генетически модифицированным микробом (ГММ), правила содержания и выпуска окружающей среды варьируются во всем мире, что усложняет масштабирование.

Оригинальное название: The Fermentation Frontier

Микробная ферментация претерпела ренессанс, усиленный генетической хирургией с CRISPR, рациональным дизайном метаболических путей и появлением интеллектуальных биореакторов. Диапазон сложных природных продуктов, доступных в настоящее время - от воскресших антибиотиков до противораковых агентов растительного происхождения и морских токсинов - быстро расширяется. В то время как проблемы титра, стоимости и одобрения регулирующих органов остаются, траектория ясна: ферментация будет все чаще заменять химический синтез и естественную экстракцию в качестве основного пути ко многим из самых ценных молекул в мире. По мере того, как машинное обучение ускоряет проектирование путей и бесклеточные системы разблокируют иначе невозможную химию, следующее десятилетие обещает предоставить новое поколение ферментированных фармацевтических препаратов, агрохимикатов и промышленных ферментов, которые ранее были ограничены воображением химиков натуральных продуктов.

Основные внешние ресурсы для дальнейшего чтения: