Table of Contents

Светолистовая флуоресцентная микроскопия стала важнейшим инструментом в биологических науках, в частности, для живой визуализации крупных, неповрежденных образцов. Осветляя лишь тонкий оптический участок образца, этот метод резко снижает фотоотбеливание и фототоксичность по сравнению с обычной широкополой или конфокальной микроскопией, позволяя исследователям наблюдать динамические процессы в течение длительных периодов. За последнее десятилетие ряд технических инноваций раздвинул границы достижимого, как с точки зрения разрешения, так и скорости. Эти достижения теперь непосредственно позволяют создавать новые экспериментальные парадигмы в биологической инженерии, от построения сложных моделей тканей до исследования активности нейронных цепей в режиме реального времени. В этой статье излагаются основные принципы микроскопии легкого листа, рассматриваются ключевые технологические прорывы, освещаются основные области применения в биологической инженерии и обсуждаются перспективные направления будущего развития.

Основной принцип микроскопии светового щита

Селективная плоская осветительная микроскопия (SPIM), более известная как светолистовая микроскопия, достигает оптического сечения путем отделения путей освещения и обнаружения. Тонкий лист лазерного света, обычно толщиной в несколько микрометров, проецируется через образец со стороны, захватывающая флуоресценция только в освещенной плоскости. Излучаемая флуоресценция затем собирается отдельной объективной линзой, ориентированной перпендикулярно оси освещения и отображается на камеру. Поскольку освещается только плоскость в фокусе, образец подвергается гораздо меньшему свету в целом, чем в методах, которые освещают весь объем. Этот принцип позволяет использовать высокие скорости получения, поскольку камера может захватывать все 2D изображение сразу, и для исключительных 3D-реконструкций путем последовательного перемещения образца или светового листа через глубину образца.

Преимущества перед обычными методами микроскопии

Конфокальная микроскопия, хотя и способна к отличному оптическому сечению, полагается на точечное сканирование и пин-хоул для отторжения света вне фокуса. Этот подход по своей сути медленнее и подвергает всю глубину образца интенсивному лазерному возбуждению во время каждого поглощения z-срезов, что приводит к кумулятивному фотоповреждению. Двуфотонная микроскопия уменьшает рассеяние и улучшает проникновение глубины, но также полагается на точечное сканирование и, в зависимости от подхода, может все еще производить значительное фотоотбеливание в фокусном объеме. Световая микроскопия обходит эти ограничения, освещая только изображенную плоскость. Это приводит к скорости получения, которая на порядки быстрее - часто десятки объемов в секунду - и значительному снижению фототоксических эффектов, что делает его методом выбора для долгосрочного визуализации развития и для наблюдения чувствительных живых образцов, таких как эмбрионы, органоиды и ломтики ткани ex vivo.

Ключевые технологические прорывы

Оригинальная конфигурация СПИМ, хотя и элегантная, страдает от нескольких практических ограничений, включая неравномерное освещение по всему полю зрения, затенение артефактов из непрозрачных структур и ограниченную глубину проникновения в рассеивающие ткани.Следующие достижения затронули многие из этих вопросов, значительно расширив применимость микроскопии светлого листа.

Недиффракционные и структурированные световые листы

Традиционные гауссовские световые листы производят чистый, тонкий участок только в ограниченном диапазоне Рэлея, ограничивая полезное поле зрения. Лучи Бесселя, которые не диффрактируют в природе, могут распространяться на более длинные расстояния, сохраняя при этом узкий центральный ядро, давая больший однородный объем изображения. Микроскопия светового листа латтиса, введенная Эриком Бетцигом и его коллегами, сочетает тонкий лист, образованный из 2D-оптической решетки, со структурированными принципами освещения. Эта конфигурация создает исключительно тонкий световой лист (тощий как 250 нм) по большому полю зрения, с резко уменьшенной фотоотбеливанием и фототоксичностью по сравнению с пучками Бесселя. Микроскопия светового листа латтиса позволила беспрецедентно быстрое, нежное, объемное изображение динамических субклеточных процессов, включая торговлю везикулами, ремоделирование цитоскелета и деление клеток в живых образцах. Обзор оптических принципов и биологических применений микроскопии светового листа решетки можно найти

Инновации в области обнаружения: адаптивная оптика и высокочувствительные камеры

Биологические образцы оптически неоднородны, вызывая аберрации, ухудшающие качество изображения, особенно на глубине. Адаптивная оптика (АО), первоначально разработанная для астрономии, использует деформируемые зеркала или пространственные модуляторы света для коррекции этих аберраций в реальном времени. Измеряя искажения волнового фронта, системы АО могут восстанавливать почти дифракционное разрешение даже глубоко внутри рассеивающих тканей, таких как мозг мухи или кора мыши. Одновременно развитие камер с обратной подсветкой с ККМОП с квантовой эффективностью выше 90% значительно улучшило соотношение сигнал-шум, позволяя исследователям еще больше снизить мощность лазера при сохранении высоких частот кадров. Сочетание быстрых камер с низким уровнем считывания шума также позволило использовать такие методы, как деконволюция светового поля и микроскопия HiLo, которая может извлекать высококонтрастную информацию из одной фокальной плоскости.

Мультивидение и мульти-уголовая визуализация

Классические изображения SPIM только одной плоскости за раз, но многие биологические структуры непрозрачны или сильно рассеяны, что приводит к затенению путем поглощения объектов (таких как пигментированные клетки) или сильному прямому рассеянию. Многозрительная микроскопия светового листа решает эту проблему, освещая образец под несколькими углами и вращая образец во время приобретения. Томографические реконструкции могут затем сливать данные из разных точек зрения, заполняя недостающую информацию. Этот подход был ключевым для крупномасштабной визуализации очищенных тканей, таких как мозг цельной мыши, и для наблюдения полного развития непрозрачных организмов, таких как эмбрион рыбки-зебра. Несколько коммерческих и открытых платформ теперь включают двухобъективные или вращающиеся системы для захвата многозрительных наборов данных.

Автоматизированная обработка образцов и высокопроизводительные рабочие процессы

Для перевода микроскопии легкого листа в рутинный инструмент для биологии и инженерии, автоматизация была необходима. Роботизированные этапы для многолуночных пластин, микрожидкостных устройств для точного позиционирования образца и автоматизированных систем фокусировки и коррекции дрейфа позволили долгосрочное приобретение в течение многих часов или дней без вмешательства пользователя. Например, объединение микроскопа легкого листа с водяной ванной и системой перфузии газа позволяет точно контролировать температуру и уровень кислорода во время разработки органоидов, имитируя физиологические условия. Программные платформы, которые обрабатывают сложные процедуры приобретения, сшивание изображений в реальном времени и управление высокопроизводительными данными были интегрированы в коммерческие системы (например, Zeiss, Leica) и проекты с открытым исходным кодом (например, OpenSPIM, ] Проект OpenSPIM . Эти достижения сделали микроскопию легкого листа доступной для лабораторий без обширного оптического инженерного опыта.

Обработка данных и роль машинного обучения

Огромные объемы данных, генерируемые современными микроскопами светового листа, часто терабайтами в эксперименте, требуют эффективных вычислительных трубопроводов. Достижения в алгоритмах деноизации изображений, деконволюции и сегментации были решающими. Подходы к глубокому обучению, особенно сверточные нейронные сети (CNN), теперь обеспечивают надежные решения этих задач. Например, неконтролируемые деноизирующие сети могут уменьшить количество требуемых фотонов, обеспечивая даже более мягкие условия визуализации. Модели машинного обучения также могут быть обучены сегментировать ядра, отслеживать клетки или реконструировать 3D-структуры из многозрительных данных, ускоряя анализ сложных процессов развития. Интеграция методов Content-Aware Image Restoration Технология Content-Aware Image Restoration оказалась особенно мощной для наборов данных с низким освещением, значительно улучшая качество изображения без увеличения фотоповреждения.

Приложения в биологической инженерии

Технологические достижения, описанные выше, непосредственно позволили создать новую волну приложений в биологической инженерии, где способность наблюдать живые системы в 3D и во времени имеет решающее значение.

Разработка органических и тканевых моделей

Органоиды — трехмерные, самоорганизованные структуры, полученные из стволовых клеток, — предназначены для репликации архитектуры и функции органов. Чтобы понять, как органоиды дифференцируются и растут, исследователи должны контролировать решения о судьбе клеток, складывании тканей и образовании просвета в течение нескольких дней или недель. Микроскопия легкого листа обеспечивает требуемую долгосрочную визуализацию низкой токсичности. Например, исследования кишечных органоидов человека использовали решетчатую световую листовую микроскопию для визуализации динамического формирования криптообразных структур и миграции клеток Панета. Аналогично, органоиды мозга были изображены для отслеживания развития нейронных розеток и появления кортикальной ламинации. Эти наблюдения являются фундаментальными для разработки более физиологически релевантных моделей тканей и для скрининга лекарств, влияющих на развитие органов. Исследование, опубликованное в Cell Stem Cell , продемонстрировало использование светового листа микроскопии для отслеживания развития органоидов мозга человека в течение более 30 дней, раскрывая новые идеи в динамике поведения нейронных клеток-предшественников.

Нейробиология: визуализация активности мозга

Светолистовая микроскопия стала мощным методом записи нейронной активности в больших популяциях нейронов. В сочетании с генетически закодированными показателями кальция (например, GCaMP) она может захватывать пространственно-временную динамику нейронного возбуждения в кусочках мозга ex vivo или даже у живых прозрачных животных, таких как личинки рыбок данио. Недавние работы расширили визуализацию светового листа в мозг мыши с помощью линз градиентного индекса (GRIN) для достижения глубоких структур или с использованием очищенных, неповрежденных мозгов для картирования аксоновых проекций дальнего действия. Высокие скорости визуализации позволяют обнаруживать индивидуальные потенциалы действия, в то время как объемное покрытие позволяет изучать явления сетевого уровня. Например, исследователи использовали световые микроскопы для изображения всего мозга личинки рыбок данио на 1-2 Гц, декодируя нейронную активность, лежащую в основе сложного поведения, такого как захват добычи и социальные взаимодействия. Эти возможности бесценны для создания, тестирования и отладки синтетических нейронных цепей, спроектированных на моделях животных.

Сосудистая биология и динамика кровотока

Способность к изображению кровотока и образования сосудов в реальном времени имеет решающее значение для понимания сосудистых заболеваний и для инженерных функциональных тканей. Микроскопия легкого листа может захватывать быстрый поток эритроцитов через капилляры, измерять нагрузку сдвига на эндотелиальные клетки и отслеживать прорастание новых сосудов во время ангиогенеза. Передовые методы, такие как микроскопия линейного сканирования легкого листа, могут достигать микросекундного разрешения времени для точных измерений скорости. В моделях мышиного уха или куриных хориоаллантоических мембран, визуализация легкого листа использовалась для отслеживания эффектов антиангиогенных препаратов. Это приложение непосредственно поддерживает разработку васкуляризированных тканей и разработку таргетной терапии для рака и ишемических заболеваний.

Тестирование лекарств и токсикология в 3D-моделях

Двумерная клеточная культура часто не в состоянии предсказать реакции на лекарственные препараты in vivo. Трехмерные сфероиды и органоиды обеспечивают более реалистичную среду для тестирования эффективности и токсичности, но их непрозрачная природа затрудняет их изображение стандартными микроскопами. Светолистовая микроскопия превосходит в этой нише, так как она может проникать в несколько сотен микрометров в сфероид с минимальной фототоксичностью. Исследователи могут контролировать поглощение флуоресцентных препаратов, измерять распределение терапевтических агентов в ткани и количественно определять апоптотические или некротические маркеры с течением времени. Высокопроизводительные платформы светового листа, способные визуализировать сотни сфероидов параллельно, в настоящее время используются для ранней стадии скрининга лекарств. Этот подход уменьшает количество необходимых экспериментов на животных и ускоряет идентификацию перспективных кандидатов на лекарства для применения в онкологии, токсикологии и персонализированной медицине.

Биология развития и исследования регенерации

Классическая микроскопия легкого листа была впервые применена в эмбриологии, и она остается краеугольным камнем для изучения развития и регенерации. Исследователи использовали SPIM для создания цифровых эмбрионов рыбок данио, плодовых мух и C. elegans, отслеживая каждое деление клеток и движение по всей временной шкале развития. Последние достижения подтолкнули эти исследования к системам млекопитающих, таким как визуализация эмбрионов мышей на этапах предимплантации. В контексте биологической инженерии эти методы позволяют ученым проверять влияние конкретных генетических модификаций или возмущений окружающей среды на морфогенез. Кроме того, регенерация у таких видов, как планарии, аксолотли и рыбки данио, изучается с помощью микроскопии легкого листа, чтобы раскрыть клеточные механизмы, которые контролируют восстановление тканей, обеспечивая вдохновение для стратегий регенеративной медицины у людей.

Будущие направления и новые возможности

Хотя микроскопия легких листов уже преобразила многие области биологии и техники, текущие исследования продолжают расширять ее охват.

Интеграция с другими модальностями

Сочетание микроскопии легкого листа с комплементарными методами может дать более богатые наборы данных. Например, связь с оптической когерентной томографией (OCT) или фотоакустической визуализацией обеспечивает как флуоресценцию, так и структурный контраст. Одновременное двухфотонное и световое возбуждение листа может получить доступ к более глубоким тканевым слоям или активировать оптогенетические зонды при визуализации. Аналогично, интеграция с стимулированным рамановым рассеянием (SRS) позволяет без меток химическую визуализацию липидов, белков и метаболитов в одном и том же объеме. Эти гибридные системы будут особенно ценны для характеристики инженерных тканей, где должна быть оценена как структура, так и функция.

Глубокое обучение для контроля и анализа в реальном времени

Следующим шагом является использование искусственного интеллекта не только для пост-сессионного анализа, но и для управления микроскопом в режиме реального времени. Модели глубокого обучения теперь могут выполнять онлайн-сегментацию, обнаруживать редкие события и направлять процесс приобретения, например, автоматически увеличивая масштаб события деления клеток при сохранении широкого обзора. Этот подход «умной микроскопии» снижает потребности в хранении данных и позволяет пользователям сосредоточиться только на биологически значимых событиях. По мере того, как модели становятся более эффективными и аппаратными более мощными, эксперименты с замкнутым циклом, где микроскоп адаптируется к поведению образца, станут рутиной в биологической инженерии.

Очищенная ткань и крупномасштабная анатомия

Методы очистки тканей, такие как iDISCO+, CUBIC и CLARITY, делают неповрежденные органы прозрачными, позволяя визуализировать световой лист всего мозга мыши, опухолей или биопсий с субклеточным разрешением. Этот подход, известный как мезоскопическая визуализация, производит наборы данных в масштабе терабайтов, которые могут использоваться для картирования нейронной связи, визуализации краев опухоли или анализа распределения иммунных клеток по всем органам. Сочетание передовых протоколов очистки и многозрительных световых листовых микроскопов в настоящее время является стандартным инструментом в коннектомике и клинической патологии. Для крупномасштабной анатомии схемы освещения и обнаружения должны быстро обрабатывать объемы миллиметрового масштаба, и разрабатываются новые оптические конструкции, такие как косая плоская микроскопия, для достижения этого с минимальным нарушением образца.

Заключение

Микроскопия светового листа превратилась из нишевой техники биологии развития в универсальную платформу для визуализации в реальном времени в нескольких масштабах. Непрерывное совершенствование генерации светового листа, аппаратного обеспечения обнаружения, автоматизации и вычислительного анализа сделало его незаменимым для биологической инженерии. Его способность захватывать трехмерные данные с высоким разрешением с минимальным фотоповреждением позволяет исследователям наблюдать сложные процессы, такие как развитие органоидов, активность нейронных цепей и сосудистая динамика в их полном физиологическом контексте. По мере того, как поле движется к более умным, быстрым и более интегрированным системам, микроскопия легкого листа, несомненно, будет играть центральную роль в разработке, проверке и развертывании следующего поколения инженерных биологических систем.