Достижения в области сосудистой тканевой инженерии для регенерации легких

Введение: Критическая роль сосудистой системы в регенерации легких

Заболевания легких, такие как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), легочный фиброз и кистозный фиброз, затрагивают сотни миллионов людей во всем мире. Для терминальных стадий трансплантация легких остается единственным лечебным вариантом, но она сильно ограничена нехваткой донорских органов, хроническим отторжением и пожизненной иммуносупрессией. Тканевая инженерия и регенеративная медицина предлагают многообещающую альтернативу: способность создавать функциональную легочную ткань в лаборатории. Однако основным узким местом было воссоздание обширной и замысловатой сосудистой сети легкого. Без функциональной системы кровеносных сосудов инженерная легочная ткань не может поддерживать газообмен или поддерживать метаболические потребности респираторных клеток.

За последнее десятилетие достижения в области сосудистой тканевой инженерии приблизили нас к решению этой проблемы. Эта статья обеспечивает углубленный взгляд на последние прорывы в проектировании каркаса, клеточной биологии и интеграционных стратегий, которые движут область к клинической реальности.

Понимание сосудистой архитектуры легких

Сосудистая система легкого чрезвычайно сложна. Она состоит из двух различных циркуляций: легочной циркуляции (для газообмена) и бронхиальной циркуляции (для подачи питательных веществ в дыхательные пути). Только легочная циркуляция содержит около 300 миллиардов капилляров, образуя огромную площадь поверхности — около 70 квадратных метров — где происходит обмен кислородом и углекислым газом. Эти капилляры обернуты вокруг альвеол в плотно упакованной, стереотипной геометрии, которая максимизирует эффективность диффузии. Воспроизведение этой иерархической сети от крупных артерий до капилляров является одной из самых сложных задач в тканевой инженерии.

Эндотелий, выстилающий эти сосуды, не является однородным; он проявляет различные фенотипы в зависимости от типа сосуда (артериальный, венозный, капиллярный). Капиллярные эндотелиальные клетки, например, фенестратированы и экспрессируют специфические маркеры, такие как белок, связанный с плазмолеммой (PLVAP). Любой инженерный каркас должен не только обеспечивать правильную геометрию, но и представлять биохимические сигналы, которые направляют эндотелиальные клетки дифференцироваться в соответствующий подтип. Кроме того, сосудистая система легкого находится в постоянном механическом движении из-за дыхания и сердечной пульсативности, добавляя дополнительную сложность к конструкции прочных, совместимых сосудистых структур.

Ключевые проблемы в области васкуляризации инженерной ткани легких

Прежде чем рассматривать последние достижения, важно понять основные препятствия, с которыми сталкиваются исследователи:

Каждая из этих проблем привела к инновациям в материалах, клеточных источниках и технологиях производства.

Инновации в биоматериальных лесах для сосудистой ткани инженерии

Биоразлагаемые полимеры и децеллюляризованные матрицы

В ранних конструкциях каркасов использовались простые биоразлагаемые полимеры, такие как поли(лактико-ко-гликолевая кислота) (PLGA) и поликапролактон (PCL). В то время как они обеспечивают механическую поддержку и деградируют с течением времени, им не хватает биоактивности родного внеклеточного матрикса (ECM). Основной скачок произошел от децеллюляризированных каркасов легких — целые легкие лишены своих клеток при сохранении родной архитектуры ECM, включая сосудистую базовую мембрану. Эти клеточные каркасы сохраняют иерархическое разветвление исходного органа и присутствуют интегринсвязывающие сайты и факторы роста, которые направляют присоединение клеток и миграцию. В знаковых исследованиях исследователи смогли повторно заселить децеллюляризованные легкие крыс и человека с эндотелиальными и эпителиальными клетками, достигая ограниченного, но измеримого газообмена (см. ] Отт и др., 2010 ].

Гидрогели и природные биоматериалы

Гидрогели, состоящие из коллагена, фибрина, гиалуроновой кислоты или матригеля, широко используются, поскольку имитируют мягкую, гидратированную среду легочной ткани. Их можно вводить в виде жидких предшественников и сшивать in situ или использовать в качестве биоинков для 3D-биопечати. Примечательным примером является использование метакрилированного желатина (GelMA) в сочетании с васкулогенными факторами для генерации предваскуляризованных микротравм. Однако гидрогели сами по себе не обладают механической прочностью для поддержки перфузии под артериальным давлением; они часто сочетаются с более жесткими структурными элементами или используются в качестве слоев покрытия на пористых каркасах.

3D-биопечать и жертвенное формование

Аддитивное производство произвело революцию в изготовлении сосудистых сетей. Такие методы, как жертвенная биопечать, используют временную нить (из плуронического F127, желатина или углеводного стекла), которая печатается в форму, а затем удаляется после того, как окружающий объемный материал затвердел. Это оставляет за собой взаимосвязанные каналы, которые могут быть выстланы эндотелиальными клетками. В знаковом исследовании 2019 года исследователи напечатали модель проксимальных дыхательных путей и сосудов легкого человека с использованием биоинки на основе гидрогеля и продемонстрировали функциональную вентиляцию и кровоток в формате орган-на-чипе (] Васкес и др., 2019 . Совсем недавно многоматериальные биопринтеры могут депонировать эндотелиальные клетки, клетки гладкой мышцы и поддерживать фибробласты в одном прогоне, создавая гетерогенные стенки сосудов.

Электроспиннинг и нанофибровые леса

Электроспиннинг производит нетканые маты наноразмерных волокон, которые имитируют волокнистый ECM. Используя выровненные волокна или сборщики мандрелей, можно создавать трубчатые каналы, напоминающие мелкие артерии. В то время как электроспиннинг превосходит производство сосудов с высоким соотношением поверхности к объему, сложно создать иерархические разветвленные сети, необходимые для рекапитуляции легких. Гибридные подходы - объединение электроспун-рукавов с 3D-печатными разветвленными шаблонами - в настоящее время изучаются.

Достижения в области клеточных источников и методов культуры

Эндотелиальные клетки: от первичных до iPSC-производных

Идеальный тип клеток для васкуляризации легочной ткани - это аутологичные эндотелиальные клетки (EC), но сбор достаточного количества от пациента непрактичен. Эндотелиальные клетки человеческой пуповинной вены (HUVEC) широко используются для исследований, но они получены из крупных сосудов и не полностью повторяют фенотип микрососудистого эндотелия легких. Основным прогрессом было получение эндотелиальных клеток легких из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Перекапитулируя сигналы эмбрионального развития - такие как WNT-сигналы и стимуляция VEGF - исследователи могут генерировать EC, экспрессирующие маркеры, такие как CDH5, PECAM1 и PLVAP. Эти EC, полученные из iPSC, могут быть расширены до высоких чисел и показать перспективную приживление в децеллюляризированных каркасах.

Системы кокультуры и органоиды

Сосудистая ткань не существует изолированно; она требует поддерживающих клеток, таких как перициты, клетки гладкой мышцы и фибробласты, для стабилизации вновь образованных сосудов. Модели кокультуры показали, что мезенхимальные стромальные клетки (МКС) могут действовать как перицитоподобные клетки, обертывая протоки, вытянутые ECM и осаждая ECM, который укрепляет стенку сосуда. Органоиды легких, которые объединяют предшественников эпителия с эндотелиальными и мезенхимальными клетками, были особенно захватывающими. В исследовании 2019 года исследователи генерировали органоиды легких человека, содержащие сосудистую сеть, которая поддерживала рост дистальных структур дыхательных путей (] Дай и др., 2019 . Эти органоиды малы — миллиметрового масштаба — но они обеспечивают бесценную платформу для изучения сосудистых — эпителиальных взаимодействий и ответов на лекарства.

Биореакторные системы для созревания

Культивирование сконструированной сосудистой ткани в статических условиях дает тонкие, хрупкие сети. Биореакторы, которые применяют контролируемую перфузию, давление и циклический штамм, необходимы для созревания. Они имитируют механическую среду легкого, способствуя выравниванию EC, затягиванию клеточных соединений и увеличению производства белков ECM, таких как коллаген IV и ламинин. Современные биореакторы теперь включают датчики кислорода, рециркуляции среды и даже вентиляции, чтобы имитировать цикл дыхания. Эти системы использовались для культивирования целых децеллюляризованных долей легких в течение нескольких недель, достигая почти физиологической плотности клеток и монослойной целостности.

Стратегии для ускорения васкуляризации в Vivo

Даже самая лучшая сосудистая система, выращенная in vitro, должна подключаться к циркуляции хозяина после имплантации. Для ускорения этого анастомоза проводится несколько стратегий:

Интеграция с альвеолярной регенерацией

Конечная цель инженерии легочной ткани состоит не только в создании кровеносных сосудов, но и в создании функциональных воздухообменных узлов. Альвеол представляет собой деликатную структуру, содержащую эпителиальный слой (пневмоциты I и II типа), подвальную мембрану и эндотелиальный слой - все плотно сопоставлены. Достижения в альвеолярной регенерации параллельны сосудистым достижениям. Например, исследователи успешно засеяли децеллюляризованные каркасы как с эпителиальными клетками дыхательных путей, так и с эндотелиальными клетками легких, в результате чего области, напоминающие незрелые альвеолы. Однако достижение тонкого (<1 мкм) диффузионного барьера остается неуловимым.

Биомиметические подходы с использованием микрожидкостных чипов доказали свою ценность. Устройства Lung-on-a-chip включают два параллельных канала - один выстлан эпителием и подвергается воздействию воздуха, другой выстлан эндотелием и перфузирован средой - разделен пористой мембраной. Эта система воспроизводит ключевые особенности альвеолярно-капиллярного интерфейса и использовалась для изучения механизмов токсичности лекарств и болезней (]Huh et al., 2010 ). Перевод этих принципов в макроскопические, имплантируемые конструкции является основным направлением исследований.

Еще одним перспективным направлением является использование легочных органоидов, которые содержат как эпителиальные, так и эндотелиальные предшественники. Когда эти органоиды выращиваются в биореакторе с циклическим растяжением и перфузией, они развивают более зрелые альвеолярные структуры. Некоторые органоиды даже производят поверхностно-активное вещество, белково-липидный комплекс, необходимый для снижения поверхностного натяжения. Комбинирование васкуляризированных легочных органоидов с 3D-печатными каркасами может дать гибридные конструкции с определенной макроархитектурой и микромасштабными функциональными единицами.

Клинический перевод

Несмотря на значительный прогресс, полностью васкуляризированное искусственное легкое еще не было протестировано на людях. Препятствия огромны. Доклинические исследования на крупных животных (свиньях, овцах) показали, что децеллюляризованные легкие могут быть рецеллюляризированы и имплантированы в течение коротких периодов времени, но долгосрочная проходимость и устойчивая функция не были продемонстрированы. Иммунный отказ от аллогенных клеток остается проблемой; аутологичные клетки, полученные из iPSC, могут преодолеть это, но они требуют дорогостоящего, персонализированного производства. Регуляторные пути также неясны: следует ли классифицировать васкуляризованную конструкцию легкого как устройство, биологический или комбинированный продукт?

Тем не менее, в настоящее время проводится несколько клинических испытаний для более простых васкуляризированных тканей. Например, тканеинженерные сосудистые трансплантаты для детской сердечно-сосудистой хирургии вошли в ранние фазовые исследования. Уроки, извлеченные из этих применений, такие как важность антикоагуляции, противовоспалительных покрытий и клеточных источников, будут непосредственно информировать о разработке конструкций легких. Первое клиническое применение для легочной ткани может быть не целым органом, а патчем или сегментом, предназначенным для замены поврежденной области у пациентов с локализованным заболеванием легких.

Будущие направления

Точная медицина и вычислительный дизайн

Специфическая визуализация пациента (КТ, микро-КТ) теперь может обеспечить цифровые модели сосудистой системы легких с микронным разрешением. В сочетании с вычислительной динамикой жидкости исследователи могут оптимизировать конструкцию каркаса для минимальной сопротивления потоку и равномерной перфузии. Алгоритмы машинного обучения обучаются прогнозировать, как эндотелиальные клетки будут реагировать на различные геометрии и биохимические сигналы, что позволяет быстрее итерировать конструкции каркаса.

Побочные продукты

Для широкого клинического использования инженерные ткани легких должны быть доступны «вне полки». Это требует надежных методов криоконсервации для васкуляризированных конструкций и универсальных донорских клеточных линий, которые являются гипоиммуногенными. Генно-редактированные ИПСК (например, с делециями генов MHC или сверхэкспрессией CD47) разрабатываются, чтобы избежать как клеточного, так и гуморального отторжения, потенциально позволяя одной клеточной линии служить многим пациентам.

В Situ Tissue Engineering

Вместо того, чтобы выращивать ткани в лаборатории и имплантировать их, подходы in situ направлены на то, чтобы набрать собственные клетки пациента на каркас, помещенный в тело. Инъекционные гидрогели, которые образуют сосудистые каналы при воздействии ближнего инфракрасного света, или каркасы, которые выделяют химиоаттрактанты для эндотелиальных предшественников, могут минимизировать потребность в культуре ex vivo. Этот подход согласуется с тенденцией к минимально инвазивным вмешательствам.

Заключение

Достижения в области сосудистой тканевой инженерии неуклонно разрушают барьеры для функциональной регенерации легких. Инновации в биоматериалах - от децеллюляризованной ECM до 3D-печатных гидрогелей - теперь позволяют создавать иерархические, перфузионные сосудистые сети. Параллельный прогресс в биологии стволовых клеток позволил генерировать эндотелиальные клетки, специфичные для легких, и совместно культивировать их с эпителиальными и мезенхимальными клетками в органоидных и биореакторных системах. В то время как проблемы масштаба, иммунной совместимости и долгосрочной интеграции остаются, область движется ближе к клинике. Продолжение междисциплинарного сотрудничества между инженерами, биологами и клиницистами будет иметь важное значение для перевода этих прорывов в реальные методы лечения.

Для миллионов пациентов, страдающих хроническими заболеваниями легких, перспектива регенерированного, васкуляризованного легкого больше не является отдаленной фантазией, а ощутимой целью исследования.