Достижения в области сосудистой ткани для трансплантации островков поджелудочной железы

Последние достижения в области сосудистой тканевой инженерии значительно улучшили успех трансплантации островков поджелудочной железы, предлагая новую надежду для пациентов с диабетом 1 типа. Эти инновации направлены на создание поддерживающей сети кровеносных сосудов, которая повышает выживаемость и функцию островков после трансплантации. Решая фундаментальное ограничение недостаточного кровоснабжения, исследователи трансформируют ранее маргинальную процедуру в потенциальную стандартную терапию. В этой статье исследуется текущее состояние сосудистой тканевой инженерии для трансплантации островков, подробно описываются проблемы, недавние прорывы и будущие направления, которые обещают сделать этот подход устойчивым и широко применимым лечением инсулинозависимого диабета.

Понимание трансплантации островков поджелудочной железы

Трансплантация островков поджелудочной железы предполагает выделение инсулин-продуцирующих бета-клеток из донорских поджелудочных желез и вливание их в портальную вену реципиента. Цель состоит в том, чтобы восстановить эндогенную секрецию инсулина и добиться инсулиновой независимости. Впервые успешно проведенная в 1970-х годах процедура набрала обороты после того, как Эдмонтонский протокол (2000) продемонстрировал, что безстероидный иммуносупрессивный режим может давать устойчивую инсулиновую независимость в течение двух лет. Однако долгосрочные результаты остались разочаровывающими: менее 50% реципиентов сохраняют инсулиновую независимость через пять лет, а большинству требуется возврат к экзогенной инсулинотерапии.

Основной задачей было обеспечение того, чтобы эти клетки получали достаточное кровоснабжение для выживания и эффективного функционирования. Без надлежащей васкуляризации многие пересаженные островки терпят неудачу, снижая общий успех процедуры. Островки очень метаболически активны и требуют кислорода и питательных веществ, доставляемых через плотную микроваскулатуру. В родной поджелудочной железе каждый островок перфузируется специализированной сетью фенестратированных капилляров, которые поддерживают быстрое высвобождение инсулина. Когда островки пересаживаются в воротную вену, они поселяются в печеночных синусоидах и полагаются на существующую микроциркуляцию печени.

Однако начальная сосудистая фаза — первые несколько дней до нескольких недель после трансплантации — приводит к глубокой гипоксии и лишению питательных веществ, что приводит к потере до 60% массы трансплантата.

Кроме того, внутрипортальный участок представляет дополнительные препятствия: более низкое напряжение кислорода в печени (приблизительно 5-10 мм рт.ст. по сравнению с панкреатическими уровнями 40 мм рт.ст.) дополнительно напрягает островки, а немедленный воспалительный ответ способствует гибели клеток посредством высвобождения цитокинов и прямой иммунной атаки. Эти факторы вместе объясняют, почему часто требуются множественные донорские поджелудочные железы для достижения независимости инсулина при обычной трансплантации. Сосудистая тканевая инженерия непосредственно устраняет эти ограничения, создавая выделенное кровоснабжение, которое имитирует нативную островковую среду.

Проблема гипоксии при трансплантации островков

Гипоксия, возможно, является единственным самым большим барьером для успешной приживления островков. Пересаженные островки подвергаются воздействию низких напряжений кислорода в синусоидах печени, где парциальное давление кислорода составляет примерно 5-10 мм рт.ст. - намного ниже ~40 мм рт.ст., что бета-клетки испытывают в поджелудочной железе. Островки также являются аваскулярными в течение первых 2-4 дней после трансплантации, потому что естественный процесс реваскуляризации требует времени для хозяев эндотелиальных клеток, чтобы проникнуть и сформировать новые микрососуды. Во время этого критического окна, островковые клетки должны выжить на диффузии в одиночку, что недостаточно для их высокой метаболической потребности. Клетки в ядре островка, наиболее удаленные от источника кислорода, подвергаются некрозу или апоптозу, что приводит к снижению функциональной массы.

Исследования показали, что даже после завершения реваскуляризации (обычно через 7-14 дней после трансплантации) плотность вновь образованных сосудов внутри трансплантата остается ниже, чем у родных островков. Полученная хроническая легкая гипоксия нарушает секрецию инсулина, стимулируемую глюкозой, снижает содержание инсулина в клетке и делает бета-клетки более восприимчивыми к аутоиммунной атаке или отторжению аллотрансплантата. Вазкулярная тканевая инженерия направлена на преодоление этих дефицитов кислорода путем обеспечения предварительно сформированной сосудистой сети, которая может быстро интегрироваться с кровообращением хозяина, тем самым сокращая или устраняя сосудистый период.

Роль сосудистой ткани инженерии

Вазкулярная тканевая инженерия фокусируется на разработке искусственных сетей кровеносных сосудов, которые могут интегрироваться с тканью хозяина.

При помощи инженерии выделенного сосудистого слоя ученые могут создать трансплантируемую конструкцию, которая ведет себя скорее как мини-орган, чем простая клеточная суспензия. Эта стратегия также позволяет включить защитные функции, такие как мембраны иммуноизоляции или градиенты ангиогенного фактора, для дальнейшего улучшения результатов. Конечной целью является получение готового васкуляризованного островкового трансплантата, который может быть имплантирован в последовательный участок (например, подкожный, сумчатый мешок или внутримышечный) с предсказуемой прививкой и долгосрочной долговечностью.

Стратегии преваскуляризации

В сосудистой тканевой инженерии для трансплантации островков появились два широких подхода: предваскуляризация эшафота перед засеменением островков и ко-доставка островков и сосудистых клеток в эшафоте, способствующем образованию сосудов in situ. Предваскуляризация включает имплантацию пустого эшафота или децеллюляризованной матрицы в хозяина, позволяя кровеносным сосудам хозяина проникать в течение периода от дней до недель. Затем эшафот извлекается, засевается островками и повторно имплантируется. Этот подход гарантирует, что островки сталкиваются с готовой сосудистой сетью с момента трансплантации, резко уменьшая гипоксическое повреждение. Однако он требует двухэтапной хирургической процедуры, которая усложняет клинический перевод.

Стратегии совместной доставки включают островки вместе с эндотелиальными клетками, мезенхимальными стволовыми клетками или ангиогенными факторами (например, VEGF, bFGF, PDGF) в биоматериальную каркасную среду. Эшафот служит шаблоном для роста новых сосудов, при этом клетки-хозяева и донора эндотелия сотрудничают для создания функциональной микроциркуляции. Хотя этот подход проще - требует только одной операции - он все еще страдает от отставания в течение нескольких дней до достаточной васкуляризации. Последние инновации направлены на ускорение этого процесса путем включения микрофлюидных каналов или предварительно сформированных сосудистых моделей в каркас.

Ключевые инновации в сосудистой островковой графте

За последнее десятилетие появилось несколько перспективных методов, которые приближают васкуляризированную трансплантацию островков к клинической реальности. В следующих разделах подробно описаны наиболее эффективные инновации, каждый из которых посвящен конкретным аспектам проблемы васкуляризации.

3D биопечать

3D биопечать позволяет изготавливать трехмерные конструкции с точным пространственным контролем над размещением клеток и архитектурой каркасов. Для трансплантации островков исследователи использовали биопечать на основе экструзии для нанесения чередующихся слоев гидрогеля на островковой основе и гидрогеля на эндотелиальной клетке, создавая картину, где островки окружены потенциальными сосудообразующими клетками. Заметное продвижение произошло из лаборатории Мерфи в Мичиганском университете , которая в 2021 году продемонстрировала биопечатную конструкцию ткани поджелудочной железы, содержащую человеческие островки и эндотелиальные клетки, которые сформировали патентные микрососуды в течение более 90 дней. Васкуляризированные конструкции поддерживали секрецию инсулина, реагирующую на глюкозу, с улучшенным гликемическим контролем по сравнению с не васкуляризированными элементами управления Природная биомедицинская инженерия, 2021 .

Совсем недавно микрофлюидная биопечать, где печатается жертвенный материал, а затем удаляется, чтобы оставить полые каналы, была адаптирована для создания перфузионных сосудистых сетей непосредственно в островковых каркасах. Эти каналы могут быть выстланы эндотелиальными клетками и подключены к циркуляции хозяина при имплантации, позволяя немедленное кровообращение. Хотя этот метод все еще находится на доклинической стадии, он показал перспективу в сокращении сосудистого окна до нескольких часов, а не дней.

Децеллюляризованные леса

Децеллюляризация включает удаление всего клеточного содержимого из донорского органа или ткани при сохранении внеклеточного матрикса (ЭКМ) и его родной сосудистой архитектуры. Полученный каркас обеспечивает естественную основу для роста новых кровеносных сосудов и, как правило, хорошо переносится иммунологически, поскольку большинство антигенных материалов было удалено. Для трансплантации островков в качестве каркасов использовались децеллюляризованные матрицы поджелудочной железы или печени, которые могут быть повторно заселены островками и эндотелиальными клетками.

Знаковое исследование, проведенное Song et al. (2019) продемонстрировало, что децеллюляризированные поджелудочные железы крыс могут быть рецеллюляризированы с помощью человеческих островков и сосудистых эндотелиальных клеток, образуя функциональные островково-судовые единицы. При трансплантации мышам с диабетом конструкции восстанавливают нормогликемию в течение двух недель, с кривыми толерантности к глюкозе, сопоставимыми со здоровыми контрольными (] Биоматериалы, 2019 . ECM сохранил факторы роста, такие как VEGF и базовый FGF, которые стимулировали быструю инфильтрацию сосудов хозяина, сокращая время до полной васкуляризации до менее семи дней. Масштабирование этого подхода к конструкциям размером с человека остается проблемой, но достижения в области перфузии моющих средств и культуры биореактора движут поле вперед.

Фактор роста Доставка

Включение ангиогенных факторов для стимулирования образования кровеносных сосудов вокруг трансплантированных островков является дополнительной стратегией, которая может быть объединена с подходами на основе каркасов или клеток. Контролируемое высвобождение проангиогенных белков из биоразлагаемых микрочастиц или гидрогелей обеспечивает устойчивый сигнал к хозяину эндотелиальных клеток, побуждая их мигрировать в трансплантат и формировать новые сосуды. Ключевые факторы роста включают сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF) и ангиопоэтин-1.

Систематический подход был описан Luan et al. (2020), который разработал гидрогель гепариновой конъюгированной гиалуроновой кислоты, который секвестрировал и медленно высвобождал VEGF в течение четырех недель. Когда гидрогель был загружен крысиными островками и имплантирован подкожно у мышей с диабетом, островки стали полностью васкуляризованными в течение 10 дней и поддерживали нормогликемию в течение более шести месяцев Научные достижения, 2020 . Сочетание устойчивого высвобождения VEGF и присущих ангиогенных свойств ECM в гидрогеле привело к значительно более высокой плотности сосуда по сравнению с болюсной доставкой VEGF или немодифицированных каркасов.

Микрофлюидные устройства

Микрофлюидная технология позволяет создавать точно узорчатые сети микроканалов, имитирующих естественные капилляры. Эти устройства могут быть изготовлены из биосовместимых полимеров, таких как полидиметилсилоксан (ПДМС) или гидрогелей, таких как коллаген или фибрин. Островки загружаются в камеры, прилегающие к микроканалам, а каналы засеиваются эндотелиальными клетками. Когда устройство имплантируется и подключается к артерии-хозяина и вене, кровь течет по каналам немедленно, обеспечивая непрерывную перфузию островковых камер посредством диффузии через тонкую мембрану.

Исследователи из Института Висса в Гарварде разработали микрофлюидную платформу для трансплантации островков, которая включает в себя не только сосудистые каналы, но и перистальтический насос для имитации пульсативного кровотока. В исследованиях, подтверждающих концепцию, устройство поддерживало функциональные человеческие островки более 30 дней in vitro и в течение двух недель при имплантации в глазурь диабетических мышей. Быстрое установление перфузии почти полностью устранило гипоксическое окно, что привело к почти 80% выживаемости островков по сравнению с 30% в неперфузированных органах управления. В то время как современные устройства слишком велики для имплантации человека, предпринимаются усилия по миниатюризации и интеграции их с биоразлагаемыми материалами.

Биоматериалы и дизайн каркасов

Выбор биоматериала имеет решающее значение для успеха васкуляризированных островковых конструкций. Эшафот должен обеспечивать структурную поддержку, обеспечивать диффузию питательных веществ, поддерживать прикрепление и функцию клеток и разрушаться со скоростью, соответствующей новому образованию тканей. Было изучено несколько классов биоматериалов, каждый из которых имеет определенные преимущества.

Естественные лягушки

Гидрогели, полученные из природных полимеров, таких как коллаген, фибрин, альгинат, гиалуроновая кислота и желатин, обеспечивают высокую биосовместимость и гидратированную среду, аналогичную нативной ECM. Коллаген и фибриновые гидрогели широко используются, поскольку они содержат интегринсвязывающие участки, которые способствуют адгезии и миграции клеток. Алгинат, извлеченный из морских водорослей, особенно привлекателен, поскольку он может быть сшит в мягких условиях и имеет длинный послужной список клинической безопасности в островковой инкапсуляции. Однако альгинат сам по себе не поддерживает адгезию клеток, если не модифицирован пептидами RGD. Гибридные гели, сочетающие альгинат с коллагеном или фибрином, предлагают компромисс, обеспечивая как биосовместимость, так и клеточно-чувствительную деградацию.

Синтетические полимеры

Синтетические полимеры, такие как поли(молочная ко-гликолевая кислота) (PLGA), поликапролактон (PCL) и поли(этиленгликоль) (PEG), позволяют точно контролировать скорость деградации, механические свойства и пористость. PLGA каркасы могут быть изготовлены с контролируемыми размерами пор через выщелачивание соли или электроспиннинг, и они деградируют путем гидролиза в биосовместимые побочные продукты. Одной из проблем с синтетическими полимерами является их отсутствие внутренних биологических сигналов; они должны быть функционализированы с помощью клеевых пептидов или факторов роста для поддержки васкуляризации и выживания островков. PEG гидрогели, например, могут быть модифицированы с матричными металлопротеиназами (MMP)-чувствительными сшивающими устройствами для обеспечения клеточной опосредованной деградации и ремоделирования.

ЭКМ с целлюлярной формой

Как обсуждалось ранее, децеллюляризованные ЭХМ-каркасы сохраняют нативную ультраструктуру и биохимический состав ткани. Они содержат сложную смесь коллагенов, ламининов, фибронектина, протеогликанов и связанных факторов роста, которые практически невозможно воспроизвести синтетическим путем. Основными ограничениями являются вариабельность между донорами, риск неполной децеллюляризации (которая может вызвать иммунные реакции) и сложность масштабирования производства. Тем не менее, децеллюляризованные каркасы остаются одной из наиболее перспективных платформ для васкуляризованных островковых конструкций, особенно когда они получены из поджелудочной железы или печени.

Клинический перевод и регуляторные проблемы

Хотя доклинические результаты обнадеживают, путь к клиническому одобрению васкуляризированных островковых конструкций чреват проблемами. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) регулирует эти продукты как комбинированные продукты (клеточная терапия плюс устройство / биоматериал) или как тканевая медицинская продукция. Требования к безопасности и эффективности строгие: конструкции должны демонстрировать последовательное производство, стерильность, отсутствие опухолевости и контролируемую иммуногенность. Кроме того, поскольку конструкции содержат живые человеческие островки (обычно от умерших доноров), цепочка поставок ограничена и подвержена тем же проблемам доступности доноров, которые преследуют обычную трансплантацию островков.

Другим серьезным препятствием является необходимость иммуносупрессии для предотвращения отторжения как островков, так и любых аллогенных эндотелиальных клеток или компонентов каркаса. Активно исследуются иммуномодулирующие стратегии, такие как котрансплантация регуляторных Т-клеток, использование мембран иммуноизоляции или инкапсуляция островков в гидрогелях, исключающих иммунные клетки. Однако эти подходы должны быть тщательно разработаны, чтобы не препятствовать сосудистой интеграции или диффузии кислорода. В клинических испытаниях 2019 года в Европе оценивалось предваскуляризированное подкожное устройство (система бета-O2) для трансплантации островков у восьми пациентов с диабетом 1 типа. В то время как устройство успешно поддерживало функцию островков у некоторых пациентов, три требовали удаления из-за окклюзии устройства или инфекции, подчеркивая необходимость улучшения биоматериалов и инфекционного контроля Диабетология, 2019 .

Несмотря на эти препятствия, область быстро развивается. Несколько академических центров получили финансирование от Фонда исследований диабета среди несовершеннолетних (JDRF) и Национального института здравоохранения (NIH) для разработки конструкций островков с васкуляризацией следующего поколения. Ожидается, что в начале 2025 года начнется тестирование биопечатного васкуляризированного островкового пластыря (спонсируемое ] Volumetric GmbH . В исследовании будет оцениваться безопасность и предварительная эффективность у 20 взрослых с плохо контролируемым диабетом 1 типа.

Будущие направления

Заглядывая вперед, несколько сходящихся тенденций, вероятно, ускорят развитие прочных васкуляризированных островковых трансплантатов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC)-производные островки предлагают потенциал для безграничного снабжения бета-клетками, устраняя дефицит доноров. Объединение островков, полученных из iPSC, с сосудистой тканевой инженерией может производить универсальные, готовые к имплантации трансплантаты. Исследователи уже тестируют островковые кластеры, полученные из iPSC, в васкуляризированных лесах; ранние результаты у нечеловеческих приматов показывают надежную секрецию инсулина и долгосрочный гликемический контроль.

Редактирование генов предлагает другой путь: инженерные островки или эндотелиальные клетки для уклонения от иммунного распознавания (например, путем выбивания молекул класса I MHC или экспрессии иммуномодулирующих белков) могут уменьшить или устранить необходимость иммуносупрессии. В сочетании с васкуляризированной каркасом, который обеспечивает защищенную нишу, такие трансплантаты могут достигать постоянной приживления без лекарств. Предварительные исследования с использованием CRISPR-отредактированных свиных островков в васкуляризированных децеллюляризированных матрицах показали перспективу в предотвращении отторжения через ксенотрансплантатные барьеры.

Продвинутые методы визуализации и мониторинга будут иметь важное значение для клинического успеха. Магнитно-резонансная томография (МРТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) могут неинвазивно отслеживать местоположение, жизнеспособность и васкуляризацию имплантированных конструкций с течением времени. Интеграция контрастных агентов визуализации в каркас (например, наночастицы оксида железа для МРТ) позволит клиницистам оценить функцию трансплантата и обнаружить осложнения на ранней стадии.

Наконец, персонифицированная конструкция каркаса с использованием данных визуализации для конкретного пациента и вычислительного моделирования может оптимизировать размещение сосудистых каналов в соответствии с индивидуальной анатомией. Алгоритмы машинного обучения могут предсказать лучшую геометрию для доставки кислорода и питательных веществ, минимизируя диффузионные расстояния и максимизируя выживаемость островков. Этот уровень настройки еще не практичен, но достижения в аддитивном производстве и цифровом побратимстве приближают его к реальности.

Заключение

Достижения в области сосудистой тканевой инженерии обладают потенциалом для преобразования трансплантации островков поджелудочной железы, что делает ее более жизнеспособным и распространенным лечением диабета 1 типа. Решая фундаментальную проблему недостаточного кровоснабжения, эти технологии могут спасти большинство пересаженных островков от гипоксической смерти, улучшить долгосрочную функцию и уменьшить количество доноров, необходимых для реципиента. По мере созревания биопечати, децеллюляризированных лесов, микрофлюидики и систем доставки факторов роста приближается день, когда одиночный, готовый васкуляризированный островковый трансплантат может восстановить длительную независимость от инсулина. Продолжающиеся междисциплинарные усилия - объединение материаловедения, клеточной биологии, иммунологии и хирургических инноваций - необходимы для преодоления оставшихся препятствий и улучшения результатов лечения пациентов. Обещание велико: функциональное лечение для миллионов людей, живущих с инсулинозависимым диабетом.