Достижения в области технологий биопечати для сосудистого графтового производства

Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущей причиной смерти во всем мире, что вызывает острую потребность в эффективных решениях для сосудистых трансплантатов. В то время как аутологичные трансплантаты являются золотым стандартом, их ограниченная доступность и заболеваемость донорских участков стимулировали интенсивные исследования в тканевых альтернативах. Биопечать возникла как преобразующая технология для изготовления сосудистых трансплантатов с точным контролем геометрии, распределения клеток и состава материала. Недавние прорывы в методах печати, разработке биоинконверта и постпечатном созревании приближают функциональные сосудистые трансплантаты пациента к клинической реальности.

В этой статье подробно рассматриваются современные методы биопечати для изготовления сосудистых трансплантатов, охватывающие основные печатные платформы, материальные инновации, интеграцию факторов роста, механическое кондиционирование и путь к переводу. Мы также обсуждаем постоянные проблемы, такие как масштабируемость, долгосрочная проходимость и интеграция с хостом, а также перспективные будущие направления.

Клинический императив для инженерных сосудистых трансплантатов

Более 1,5 млн процедур шунтирования коронарных артерий ежегодно проводятся по всему миру, но синтетические трансплантаты, такие как Dacron и расширенный политетрафторэтилен, остаются неоптимальными для применения на малых диаметрах (до 6 мм) из-за тромбоза, интимальной гиперплазии и инфекции. Тканеинженерные сосудистые трансплантаты (TEVG) с использованием живых клеток и биосовместимых каркасов предлагают потенциал для роста, ремоделирования и саморемонта. Биопечать позволяет изготавливать TEVG со сложными, специфическими для пациента геометриями и пространственно контролируемыми распределениями клеток и внеклеточных матриксов (ECM), которые не могут быть достигнуты с использованием традиционных методов литья или электроспиннинга.

Биопечатные платформы для сосудистого графтового производства

Для сосудистой тканевой инженерии были адаптированы три основных метода биопечати: струйная, экструзионная и лазерная биопечать. Каждое из них обеспечивает балансовое разрешение, скорость, жизнеспособность клеток и способность обрабатывать биоинки с высокой вязкостью. Гибридные подходы, объединяющие несколько печатных головок или технологий, также набирают обороты, чтобы использовать сильные стороны каждого метода.

Инъекционная биопечать

Инъекционная биопечать использует тепловые или пьезоэлектрические приводы для выброса капель пиколитра биоинки на подложку. Этот метод обеспечивает высокую скорость (до 10 000 капель в секунду) и разрешение до 20–50 мкм, что делает его пригодным для создания сосудистых структур малого диаметра и сложных капиллярных сетей. Тепловая струя не значительно подрывает жизнеспособность клеток, при этом сообщается о выживаемости выше 85%. Однако струйная биопечать ограничена его неспособностью печатать материалы с высокой вязкостью (обычно <10 мПа·с) и риском засорения сопла при использовании клеточных агрегатов или плотных компонентов ECM.

Недавние инновации включают использование нескольких струйных сопл для последовательного нанесения различных типов клеток (например, эндотелиальных клеток и клеток гладкой мышцы) для имитации нативных слоев стенки сосуда. Исследователи из Калифорнийского университета в Сан-Диего успешно напечатали функциональный сегмент коронарной артерии с использованием модифицированного струйного принтера, демонстрируя эндотелиальную барьерную функцию и физиологические сократительные реакции.

Экструзионный биопринт

Экструзионная биопечать использует пневматическое или механическое давление для экструдирования непрерывных нитей биоинки через сопло. Этот метод может обрабатывать широкий спектр вязкости (от 30 мПа·с до > 107 мПа·с) и поддерживает использование гидрогелей, нагруженных клетками, микроносителей и децеллюляризированных ECM-формаций. Экструзия является наиболее широко используемым методом для изготовления сосудистых трансплантатов большого диаметра и многослойных структур, потому что она может осаждать толстые, механически прочные конструкции.

Коаксиальные экструзионные сопла были разработаны для одновременной печати ядра биоинки и окружающей оболочки, что позволяет создавать полые трубчатые структуры за один шаг.Изменяя скорость потока и геометрию сопла, исследователи могут создавать сосуды с настраиваемыми диаметрами просвета и толщиной стенок. Примечательный пример можно найти в исследовании Биофабрикация , где для печати трехслойной сосудистой системы трансплантата с эндотелием, средами и адвентициями.

Основным недостатком экструзионной биопечати является снижение жизнеспособности клеток, вызванное напряжением сдвига при экструзии, особенно при высоких давлениях и малых диаметрах сопла.Однако реологическая оптимизация биоинки и использование пневматических систем низкого давления может поддерживать жизнеспособность выше 90%.

Лазерная биопечать

Лазерная биопечать (LAB) использует импульсный лазер для испарения тонкого поглощающего слоя, генерируя импульс давления, который проталкивает каплю биоинки на принимающую подложку. Этот подход без сопла устраняет проблемы засорения и дает высокую жизнеспособность клеток (часто > 95%) и отличное разрешение (до 20 мкм). LAB особенно хорошо подходит для печати суспензий клеток высокой плотности и нежных белков ECM без денатурации.

Поскольку LAB является последовательным процессом, его пропускная способность ниже, чем струйные или экструзионные методы, что делает его менее практичным для крупномасштабного изготовления. Однако LAB преуспевает в создании шаблонных клеточных массивов и точном воспроизведении микрососудистых архитектур. Исследователи из Университета Вюрцбурга использовали LAB для печати сети капилляров в гидрогелевом каркасе, который анастомосуется с сосудами-хозяевами после имплантации в мышиную модель.

Гибридные и мультитехнологические подходы

Ни один метод биопечати не может удовлетворить все требования функционального сосудистого трансплантата. Разрабатываются гибридные системы, сочетающие экструзию для объемной структуры и струйного струя или LAB для тонких признаков и клеточного паттерна. Например, биопринтер с четырьмя печатными головками может последовательно осаждать армирующее синтетическое полимерное волокно, гидрогель для среды, приносимый в жертву материал для создания каналов и конечный слой эндотелиальных клеток. Такие комбинаторные стратегии необходимы для создания трансплантатов, имитирующих механическую анизотропию и трислойную архитектуру нативных артерий.

Биоинки для сосудистого трансплантата: от гидрогелей до умных материалов

Биоинка, возможно, является наиболее важным компонентом в биопечатных сосудистых трансплантатах. Она должна обеспечивать подходящую среду для выживания и дифференциации клеток, обладать достаточными механическими свойствами, чтобы выдерживать физиологические давления, и поддерживать образование сосудистой сети. Достижения в составах биоинки значительно расширили пространство проектирования.

Природные биоматериалы

Коллаген I типа, желатин, фибрин, гиалуроновая кислота и альгинат являются наиболее часто используемыми природными биоинками. Каждый из них имеет уникальные преимущества: коллаген обеспечивает нативные сигналы ECM для прикрепления клеток; желатин поддерживает распространение клеток и является термообратимым; фибрин является мощной ангиогенной матрицей; и альгинат позволяет быстрое ионное сшивание для печати высокой точности. Однако природные материалы часто не имеют механической прочности, необходимой для несущих нагрузку сосудистых применений. Композитные гидрогели, которые смешивают два или более природных полимеров, могут улучшить жесткость, скорость деградации и совместимость клеток.

Биоинки децеллюляризованного внеклеточного матрикса (dECM) сохраняют тканеспецифические биохимические и биофизические сигналы. dECM из свиных артерий или человеческих пуповинных вен можно растворить и переформулировать в печатный гель, который сохраняет факторы роста, коллаген, эластин и гликозаминогликаны. Недавние работы из Передовая наука показали, что сосудистые биоинки dECM способствуют дифференцировке стволовых клеток в эндотелиальные и гладкие мышечные линии более эффективно, чем однокомпонентные гидрогели.

Синтетические и полусинтетические полимеры

Синтетические полимеры, такие как поликапролактон (PCL), поли(молочная ко-гликолевая кислота) (PLGA) и полиуретан, обладают настраиваемыми механическими свойствами и контролируемой деградацией. Они часто печатаются в качестве жертвенного или укрепляющего каркаса рядом с гидрогелями, нагруженными клетками. Например, оболочка PCL, напечатанная вокруг желатин-алгинатного ядра, обеспечивает окружную прочность для сопротивления артериальному давлению, в то время как внутренний гидрогель со временем деградирует, чтобы оставить ECM, полученный из клеток.

Гидрогели полиэтиленгликоля (ПЭГ) могут быть спроектированы с биоактивными лигандами (например, пептиды RGD) и сшитыми с помощью фотополимеризации для достижения пространственного и временного контроля жесткости. Такие платформы позволяют исследователям имитировать постепенное ужесточение, связанное со старением сосудов или болезнью. Однако синтетические полимеры не имеют внутренних клеточно-инструктивных сигналов естественного ECM и часто требуют ковалентного прививки клеевых пептидов для поддержки функции клеток.

Композитные и многоматериальные биоинки

Наиболее передовые биоинки объединяют природные и синтетические компоненты для синергии их свойств. Например, смесь желатинового метакрилоила (GelMA) - PEG-диакрилата (PEGDA) обеспечивает биосовместимость желатина с фотохимическим сшиванием и механической прочностью PEG. GelMA особенно популярна для сосудистой биопечати из-за ее клеточно-клеящих мотивов и матричных металлопротеиназно-чувствительных сшиваний, которые позволяют ремоделировать клетки.

Другой перспективный подход включает микрогели или нановолокна в биоинкерах для повышения печатаемости и механической прочности без ущерба для жизнеспособности клеток. Разжижающие стрижку и самоисцеляющиеся гидрогели, которые восстанавливают свою структуру после печати, также находятся в стадии разработки, что позволяет создавать сложные геометрии, которые в противном случае разрушились бы.

Функциональные добавки и доставка факторов роста

Включение ангиогенных факторов роста, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста тромбоцитов (PDGF) непосредственно в биоинки могут ускорить васкуляризацию. Контролируемые стратегии высвобождения с использованием гепарин-функционализированных наночастиц или поли(лактико-капролактонов) микросфер, встроенных в биоинку, обеспечивают устойчивую, локализованную доставку, которая имитирует физиологические градиенты. Исследователи также включили доноров оксида азота или антимикробные пептиды для снижения тромбоза и риска инфекции - две основные причины недостаточности трансплантата.

Проектирование микроархитектуры сосудистых графтов

Помимо состава материала, трехмерная архитектура биопечатных трансплантатов критически влияет на их функциональность.Исследователи исследовали различные геометрии, от простых трубок до разветвленных сетей, и включили функции, чтобы направлять выравнивание клеток и улучшать массовый транспорт.

Слой за слоем Строительство судовой стены

Нативные артерии состоят из трех различных слоев: tunica intima (эндотелий), tunica media (гладкая мышца) и tunica adventureitia (соединительная ткань). Биопечать позволяет воспроизводить эту слоистую структуру путем последовательной печати различных биоинков и клеточных популяций. Например, недавнее исследование напечатало двухслойный трансплантат с внутренним слоем эндотелиальных клеток пуповинной вены человека (HUVEC) в гидрогеле GelMA-фибрина и наружный слой клеток гладкой мышцы в коллаген-алгинате матрицы. После двух недель культуры конструкция показала флюентный эндотелий и выровненные клетки гладкой мышцы, которые сокращались в ответ на вазоактивные агенты.

Полые трубки и микроканальные сети

Жертвенная биопечать, с использованием таких материалов, как Pluronic F127 или желатин, позволяет создавать канальные сети, которые впоследствии могут быть перфузированы для доставки питательных веществ и кислорода. После печати жертвенного рисунка в объемном гидрогеле материал удаляется изменением температуры или растворением, оставляя после себя взаимосвязанный просвет. Этот метод использовался для изготовления каналовых сетей диаметром до 200 мкм, которые поддерживают эндотелиализацию и перфузию.

Многомасштабные иерархические архитектуры, которые объединяют каналы большого диаметра с разветвленными микрососудами, необходимы для подключения инженерных трансплантатов к сосудистой системе хозяина. Знаковое исследование в Природная биомедицинская инженерия продемонстрировала биопечатную конструкцию, содержащую центральную 4-мм артерию, связанную с 12 меньшими ветвящимися артериолами, все выстланные эндотелиальными клетками. При имплантации в дефект бедренной артерии крысы трансплантат оставался патентным до 12 недель и поддерживал врастание ткани.

Механическое усиление и анизотропия

Сосудистые трансплантаты должны выдерживать циклическое окружное напряжение, продольное напряжение и напряжение сдвига от кровотока. Родные артерии обязаны своей механической анизотропией выровненным коллагеновым и эластиновым волокнам, которые обжимаются в спиральном рисунке. Биопечать может пересчитать эту анизотропию, контролируя ориентацию экструдированных нитей. Например, печать биоинкерных нитей под переменными углами ±45° производит плетеный рисунок, имитирующий сократительную ориентацию медиального слоя и обеспечивающий биаксиальную прочность.

Усиление электроспун-волокнами или печатными синтетическими полимерами дополнительно улучшает давление разрыва и удержание шва. Гибридный трансплантат с внутренним слоем GelMA-HUVEC и внешней микрофильмной сеткой PCL достиг давления разрыва более 1200 мм рт.ст., превысив типичный диапазон артерий (200-300 мм рт.ст.). Такие механически прочные трансплантаты можно немедленно обрабатывать хирургическим путем, устраняя необходимость в длительном предварительном кондиционировании в биореакторе.

Биореакторы и стратегии созревания

После биопечати трансплантат должен созревать в биомиметической среде для развития прочности и функции тканей. Биореакторы, применяющие пульсационный поток, циклическое растяжение и электрическую стимуляцию, ускоряют осаждение ECM и выравнивание клеток.

Пульсатильные перфузионные биореакторы

Перфузия с культуральной средой при физиологических давлениях (80-120 мм рт.ст. систолического, 60-80 мм рт.ст. диастолического) способствует выравниванию эндотелиальных клеток в направлении потока, повышению сдвига стрессоустойчивости и снижению тромбогенности. Одновременно циклическая инфляция и дефляция стенки сосуда (до 10% деформации) активизирует сократительные белки гладкомышечных клеток и синтез коллагена. Системы биореакторов с замкнутой обратной связью могут поддерживать заданные профили потока и кислородное напряжение в течение недель, производя трансплантаты с механическими свойствами, приближающимися к таковым у нативных артерий.

Динамическое растяжение и электромеханические стимулы

Циклическое одноосное или биаксиальное растяжение трансплантата во время культивирования дополнительно усиливает тканевую анизотропию. В сочетании с электрической стимуляцией (особенно для клеток гладкой мышцы) биореакторы могут стимулировать экспрессию зрелых маркеров, таких как α-гладкий мышечный актин, кальпонин и миозин тяжелой цепи. Эти стимулы особенно важны для клеток гладкой мускулатуры, полученных из стволовых клеток, которые, как правило, остаются в синтетическом, пролиферативном состоянии без соответствующих механических сигналов.

Стратегии эндотелиализации

В то время как посев эндотелиальных клеток в просвет после печати является обычным явлением, in situ эндотелиализация - где трансплантат захватывает циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) из кровотока - является привлекательной альтернативой, поскольку она позволяет избежать задержек культуры in vitro. Модификация поверхности с противовоспалительными полимерами, гепарином или антителами против CD34 (маркер EPC) может способствовать быстрой эндотелиализации in vivo. Биопечать может включать эти функциональные покрытия непосредственно на поверхности просвета с использованием специальной печатной головки.

Проблемы масштабирования и клинического перевода

Несмотря на впечатляющий прогресс в лабораторных исследованиях, перевод биопечатных сосудистых трансплантатов в клиническую практику сталкивается с несколькими препятствиями.Наиболее актуальными являются масштабируемость, стерилизация, долгосрочная стабильность и одобрение регулирующих органов.

Масштабируемость и воспроизводимость производства

Большинство исследований биопечати производят трансплантаты длиной 5-10 см и диаметром 3-6 мм. Масштабирование до длины, необходимой для обхода бедренной артерии (до 60 см) или трансплантатов коронарной артерии (15-20 см) требует больших объемов печати и более длительного времени изготовления, что рискует жизнеспособностью клеток и деградацией биоинки. Многосопловые печатные головки и стратегии параллелизации могут улучшить пропускную способность, но они создают проблемы в поддержании равномерной плотности клеток и механических свойств по всему трансплантату.

Стерилизация и сохранение

Терминальная стерилизация живых тканевых трансплантатов без ущерба для жизнеспособности клеток является основным препятствием. Облучение электронным лучом, оксид этилена и гамма-излучение в стандартных дозах убивают клетки млекопитающих. Альтернативы, такие как сверхкритическая стерилизация CO2 или коктейли с антибиотиками, требуют валидации. Некоторые группы разрабатывают децеллюляризованные биопечатные трансплантаты, которые могут быть окончательно стерилизованы, а затем рецеллюляризированы непосредственно перед имплантацией, но дополнительная сложность может задержать принятие нормативных требований.

Сохранение биопечатных трансплантатов для хранения и транспортировки является еще одной проблемой. Витрификации криопротектором позволяет замораживать клеточные конструкции, но наличие больших объемов гидрогеля может привести к кристаллизации льда и повреждению. Достижения в криоконсервации с использованием синтетических модуляторов льда и контролируемых скоростей охлаждения улучшили выживаемость, но долгосрочное хранение (от нескольких месяцев до нескольких лет) не было продемонстрировано.

Иммунный ответ и долгосрочная патентность

Даже с аутологичными клетками материалы каркаса могут провоцировать реакции инородного тела. Остаточные сшивающие устройства, деградированные фрагменты полимера и загрязняющие вещества могут вызывать хроническое воспаление, фиброз и окклюзию трансплантата. Использование децеллюляризованного матрикса или высоко биосовместимых материалов помогает, но иммунный ответ на аллогенные клетки (если используется для коммерческих готовых продуктов) должен управляться с помощью иммуносупрессии или инкапсуляции клеток.

Долгосрочная проходимость биопечатных трансплантатов на крупных животных моделях (овцы, свиньи) была зарегистрирована в течение 12 месяцев, но клинические испытания на людях не были завершены. Неоинтимальная гиперплазия на анастомотических участках остается проблемой, обусловленной несоответствием между трансплантатом и родной артерией. Могут потребоваться предварительные или антипролиферативные лекарственные покрытия.

Будущие направления: интеллектуальные биоинки, печать на месте и машинное обучение

Реагирующие и разлагаемые биоинки

Следующее поколение биоинки будет включать стимул-отзывчивые фрагменты, которые изменяют жесткость, ухудшаются в ответ на ферментативную активность или высвобождают терапевтические агенты по требованию. «4D биопечать», где печатная конструкция изменяет форму с течением времени в ответ на тепло, рН или ферментативные сигналы, может производить самопрокатные трубки или самоанастомозирующие структуры, которые упрощают имплантацию.

Биопечать в ситу

Разрабатываются портативные биопринтеры, которые осаждают биоинку непосредственно на раневое место или сосудистый дефект. Такой подход может устранить необходимость в сборных трансплантатах и позволить индивидуальное формование анатомии пациента. Для сосудистых применений печать трубки малого диаметра на кровоточащем сосуде может служить герметиком или трубопроводом. Первоначальные исследования на моделях свиней показали осуществимость, но достижение адекватной механической целостности и жизнеспособности клеток во влажном, динамичном хирургическом поле остается затруднительным.

ИИ и машинное обучение в биопечати

Алгоритмы машинного обучения применяются для оптимизации формулировок биоинков, параметров печати и условий культуры. Путем обучения большим наборам данных результатов печати модели могут прогнозировать оптимальную скорость сопла, давление и температуру для данного биоинка или прогнозировать жизнеспособность клеток на основе профилей сдвига. Алгоритмы генеративного проектирования также могут предлагать геометрии трансплантата, которые максимизируют динамику потока и покрытие эндотелиальных клеток. Интеграция ИИ в рабочий процесс биопечати обещает ускорить итеративное развитие эффективных сосудистых трансплантатов.

Заключение

Биопечать превратилась из технологии доказательства концепции в универсальную платформу для изготовления сосудистых трансплантатов, которые тесно перекапитулируют нативную тканевую архитектуру. Достижения в многоматериальной печати, биоинкерной химии и кондиционировании биореакторов привели к созданию трансплантатов, которые достигают впечатляющих механических свойств и поддерживают функциональную эндотелиализацию. Несмотря на выдающиеся проблемы в масштабировании, стерилизации и долгосрочной проходимости, траектория исследований указывает на клинический перевод в течение следующего десятилетия. Сочетание специфической визуализации пациента, автоматизированной биопечати и рациональной конструкции трансплантата приближает нас к цели замены больных кровеносных сосудов живыми, адаптируемыми конструкциями, которые могут расти и реконструироваться в течение жизни пациента.

По мере совершенствования методов биопечати междисциплинарное сотрудничество между учеными-материалистами, биологами, инженерами и клиницистами будет иметь важное значение для преодоления оставшихся барьеров.При устойчивых инвестициях и нормативном предвидении биопечатные сосудистые трансплантаты могут стать стандартной терапией сердечно-сосудистых заболеваний, уменьшая зависимость от синтетических протезов и донорских тканей и в конечном итоге улучшая результаты для миллионов пациентов во всем мире.