Достижения в технологиях глубокого секвенирования для обнаружения редких вариантов

Введение в глубокое секвенирование

Глубокое секвенирование, часто синонимичное с высокой пропускной способностью секвенирования, описывает процесс считывания образца ДНК или РНК многократно для достижения высокой глубины охвата на базу. Это повторное считывание не является избыточным: оно обеспечивает статистическую мощность, необходимую для отличия подлинных редких вариантов от ошибок секвенирования. Концепция возникла с появлением платформ секвенирования следующего поколения (NGS) в середине 2000-х годов, которые заменили трудоемкий метод Сэнгера. Ранние инструменты NGS производили миллионы коротких считываний за прогон, но частота ошибок 0,1-1 % означала, что варианты, присутствующие на частотах ниже 1-5%, было трудно назвать уверенно. За последнее десятилетие комбинация лучшей химии, улучшенного оборудования и сложных стратегий коррекции ошибок подтолкнула порог обнаружения к менее чем 0,1% вариантной частоте аллелей (VAF), что позволило исследователям идентифицировать мутации, которые ранее были невидимыми.

Важность нахождения редких вариантов — тех, которые встречаются менее чем у 1% населения или при низких клональных фракциях внутри человека — нельзя переоценить. При раке, например, мутации драйверов часто существуют в виде незначительных субклонов, которые могут сеять устойчивость к терапии. При редких генетических заболеваниях сложные гетерозиготные варианты или мозаичные мутации могут объяснить случаи, когда стандартное клиническое секвенирование экзомов возвращает отрицательные результаты. Глубокое секвенирование также лежит в основе исследований соматического мозаицизма в старении, квазивидов патогена и циркулирующей опухолевой ДНК (ctDNA) в жидкой биопсии. В этой статье рассматриваются основные технологические достижения, которые сделали глубокое секвенирование рутинным инструментом, текущий ландшафт приложений, постоянные препятствия и наиболее перспективные направления для следующего поколения обнаружения редких вариантов.

Ключевые технологические достижения

Платформы секвенирования следующего поколения

Современные платформы NGS отличаются длиной чтения, пропускной способностью, стоимостью за базу и профилями ошибок, но все они заметно улучшились в своей способности обеспечивать глубокое, точное покрытие. Химия секвенирования по синтезу Illumina остается доминирующей рабочей лошадкой для редких вариантов исследований из-за ее очень низких частот ошибок вызова базы (~0,1% для большинства инструментов) и способности генерировать миллиарды считываний за пробег. Серия NovaSeq X, выпущенная в 2022 году, проталкивает пропускную способность до более чем 10 миллиардов считываний на проточную ячейку, позволяя сверхглубокое секвенирование целых экзомов или целевых панелей на долю стоимости более ранних моделей. MGI Tech использует аналогичный, но отличный метод комбинаторного синтеза зондов-якорей (cPAS), который обеспечивает сопоставимую точность и даже более высокую пропускную способность в некоторых конфигурациях, что делает его конкурентоспособным вариантом для крупных популяционных исследований. Системы Ion Torrent Термо Фишера используют полупроводниковое обнаружение ионов водорода

Уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) и исправление ошибок

Одним из наиболее преобразующих нововведений для обнаружения редких вариантов является использование уникальных молекулярных идентификаторов или UMI. UMI представляет собой короткую случайную последовательность нуклеотидов, прикрепленных к каждому фрагменту ДНК до амплификации. Поскольку каждый оригинальный фрагмент получает отдельный штрих-код, секвенирующие считывания, которые происходят из одной и той же исходной молекулы, могут быть сгруппированы в «семьи». После амплификации и секвенирования считывания в пределах одного семейства, в то время как истинные варианты появляются почти у всех членов семьи, в то время как ошибки секвенирования, которые являются случайными и происходят после прикрепления штрих-кода, появляются только в меньшинстве считываний. Требуя, чтобы вариант был замечен в определенной доле считываний в пределах семейства (например, от 80% до трех порядков величины), UMI могут подавлять фоновую частоту ошибок на уровне от двух до трех порядков, достигая уровней ошибок на уровне 10-5. Коммерчески доступные UMI-методы, такие как Duplex Sequencing (

Алгоритмы передовой биоинформатики

Необработанные данные экспериментов по глубокому секвенированию бесполезны без надежных вычислительных конвейеров. Современные инструменты биоинформатики эволюционировали специально для решения проблем обнаружения редких вариантов. Ключевые достижения включают:

• Обозначающие алгоритмы: Такие инструменты, как Strelka2, Mutect2 и Vardict, включают в себя калибровку оценки базового качества и фильтрацию смещения ориентации для уменьшения ложных срабатываний от артефактов систематического секвенирования.
• Моделирование ошибок с UMI: Программное обеспечение, такое как fgbio и smCounter2, использует считывания консенсуса UMI для сжатия дубликатов считывания и построения последовательностей консенсуса, исправленных ошибками.
• Машинообразовательные классификаторы: Глубокие нейронные сети, в том числе обученные на известных истинных вариантах от крупных консорциумов, могут отличить подлинные редкие мутации от платформоспецифичного шума лучше, чем эвристические пороги. Например, Clair3 и DeepVariant были адаптированы для сверхглубоких данных и показывают снижение ложноположительных показателей.
• Гаплотипы-знающие вызовы: Методы, которые фазовые считываются в гаплотипы (такие как WhatsHap и LongPhase) улучшают чувствительность к гетерозиготным вариантам соединений и помогают разрешать низкочастотные варианты в повторяющихся областях.

Вместе эти инструменты позволяют исследователям уверенно сообщать о вариантах, присутствующих в VAF, до 0,01%, когда глубина секвенирования достаточна, и используются UMI. Без них огромный объем данных глубокого секвенирования - часто терабайты в эксперименте - был бы неуправляемым.

Приложения в медицине и исследованиях

Редкие заболевания генетика

Редкие заболевания, определяемые как условия, затрагивающие менее 1 из 2000 человек, являются коллективно распространенными, воздействуя на примерно 300 миллионов человек во всем мире. Многие из них вызваны ультраредкими вариантами, которые не захватываются стандартным секвенированием экзомов на глубине от 30 до 50 ×. Глубокое секвенирование целевых генных панелей или целых экзомов на глубине от 200 × до 500 × доказало свою высокую эффективность в выявлении мозаичных мутаций (присутствующих только в фракции клеток) и низкоуровневых соматических вариантов, которые способствуют таким расстройствам, как туберкулезный склероз, синдромы избыточного роста и эпилепсия. В знаковом исследовании, опубликованном в Генетика в медицине (2021), исследователи применили целенаправленное глубокое секвенирование (1000 ×) до 100 пациентов с недиагностированными генетическими условиями и достигли диагностического выхода 32%, по сравнению с 10-20% для стандартного секвенирования экзомов. Кроме того,

Геномика рака и жидкая биопсия

Рак — это заболевание геномной нестабильности, при котором опухоли содержат гетерогенные популяции клеток, несущих различные мутации. Глубокое секвенирование биопсий опухолей при сотнях до тысяч разрядов показывает незначительные субклоны, которые могут содержать мутации резистентности к целевым методам лечения. Например, обнаружение мутации EGFR T790M в немелкоклеточном раке легкого (часто присутствует в VAF 0,1-1 % в циркулирующей опухолевой ДНК) в настоящее время является стандартной практикой в клиническом управлении. Жидкая биопсия — анализ ДНК без клеток (cfDNA) из крови — полностью зависит от глубокого секвенирования, потому что ctDNA может составлять менее 0,1% от общей cfDNA в ранней стадии рака. Коммерческие анализы, такие как Guardant360 и FoundationOne Liquid, используют глубокое секвенирование с UMI для достижения чувствительности 85-95% для мутаций, присутствующих в VAF выше 0,1 %. Основное исследование в Глубокое секвен