Инновационные подходы к образованию синусоида печени в биоинженерных органах

Неудовлетворенная потребность в функциональной васкуляризации в производстве тканей печени

Болезнь печени составляет около двух миллионов смертей в год во всем мире, создавая срочный спрос на альтернативные методы лечения, помимо трансплантации целых органов. В то время как биоинженерная печень представляет собой многообещающее решение, эта область неоднократно сталкивалась с критическим узким местом: воссоздание сложной сосудистой сети органа & # 8217. Без функционального кровоснабжения инженерные конструкции тканей не могут поддерживать метаболическую активность, необходимую для клинической значимости. Наиболее требовательный компонент этой сосудистой проблемы заключается в репликации уникальной синусоидальной архитектуры печени & # 8217, которая лежит в основе почти каждой функции печени от детоксикации до синтеза белка.

Печень получает примерно 25% сердечного выброса через систему двойного кровоснабжения, при этом портальная вена доставляет богатую питательными веществами кровь из пищеварительного тракта и печеночной артерии, снабжающей кислородом кровь. Эти два потока смешиваются внутри синусоидов, создавая уникальную гемодинамическую среду, которая поддерживает метаболическую нагрузку органа’. Биоинженерные конструкции должны воспроизводить не только структурную структуру этих сосудов, но и динамические структуры потока, которые управляют функцией и зонированием гепатоцитов. Последние инновации в биоматериалах, биопечати и клеточном программировании, наконец, начинают решать эти сложные требования.

Понимание синусоидов печени: структура соответствует функции

Синусоиды печени представляют собой специализированные сосудистые каналы диаметром около 5-10 микрометров, которые принципиально отличаются от капилляров, обнаруженных в других органах. Их наиболее отличительной особенностью является прерывистый эндотелий, характеризующийся фенестрами — клеточными порами диаметром 100-200 нанометров — расположенными в кластерах, известных как ситопласты. Эта уникальная архитектура позволяет свободно обмениваться липопротеинами, метаболитами и отходами между кровотоком и пространством Диссе, перизинусоидальным пространством, где гепатоциты расширяют свои микроворсинки.

Не менее важными для синусоидальной функции являются фенестратный эндотелий & #8217;s ассоциированные типы клеток. Печеночные стеллатные клетки находятся в пространстве Диссе и регулируют синусоидальный тонус через сократительные механизмы, в то время как клетки Купфера выстраивают синусоидальный просвет в качестве макрофагов-резидентов ткани, ответственных за иммунное наблюдение и клиренс патогенов. Любая успешная стратегия биоинженерии должна включать или повторять взаимодействия между этими типами клеток для достижения физиологической значимости. Без надлежащей интеграции стеллатных клеток, например, конструкции не имитируют реакции регулирования давления, критические для поддержания печеночного гомеостаза.

Физическая архитектура синусоидов также диктует градиент кислорода, который устанавливает метаболическую зонацию вдоль портала к центральной оси. Перипортальные гепатоциты испытывают более высокое кислородное напряжение и преимущественно выполняют окислительный метаболизм, в то время как перицентральные гепатоциты работают в более низких кислородных средах и специализируются на детоксикационных путях. Биоинженерные конструкции, которые не могут перекапитулировать этот градиент, производят гомогенные тканевые пятна, неспособные выполнять полный спектр печеночных функций. Недавние исследования из Университета Питтсбурга & #8217; Институт регенеративной медицины Макгоуэна демонстрируют, что микрожидкие системы могут воссоздавать эти градиенты, контролируя скорости потока через инженерные синусоидальные сети.

Биоинженерные стратегии для функционального синусоидального образования

Передовые методы биопечати для микромасштабного контроля

Трехмерная биопечать развилась далеко за пределы простого осаждения клеток. Системы текущего поколения используют коаксиальные экструзионные сопла, способные печатать полые трубчатые структуры, начиная от капиллярного масштаба до макрососудистых размеров. Для синусоидальной инженерии исследователи разработали желатиновые гидрогели метакрилоил (GelMA) в смеси с гиалуроновой кислотой для создания чернил, которые поддерживают жизнеспособность эндотелиальных клеток и спонтанное образование трубок после печати. Механические свойства этих гидрогелей были оптимизированы для соответствия нативной жесткости печени примерно 400-600 Па, что способствует образованию фенестрации в печатных эндотелиальных структурах.

Особенно многообещающее развитие включает в себя жертвенную биопечать, где решётки из углеводного стекла печатаются, а затем растворяются для создания встроенных микроканалов. Эндотелиальные клетки и поддерживающие типы клеток впоследствии сеются в эти каналы посредством перфузии. Исследователи из Института Висса в Гарварде & #8217 усовершенствовали эту методологию для достижения диаметров каналов размером до 50 микрометров, приближаясь к диапазону размеров нативных синусоидов. При перфузии при физиологических напряжениях сдвига 0,5-5 дина / см2, эти конструкции развивают эндотелиальные фенестра и поддерживают барьерную функцию в течение периодов, превышающих 14 дней. Подход также позволяет пространственное моделирование направленности потока, что позволяет создавать градиенты перфузии от портала до центра в печатных тканевых блоках.

Микрофлюидные платформы для кондиционирования сдвига

Эндотелий очень чувствителен к механическим силам, и ламинарный сдвиговый стресс играет незаменимую роль в индуцировании зрелого синусоидального фенотипа. Статические условия культуры не могут вызвать сигнальные каскады - особенно те, которые включают Kruppel-подобный фактор 2 (KLF2) и эндотелиальную синтазу оксида азота (eNOS), которые приводят к образованию фенестрации и ремоделированию плотных соединений. Микрофлюидные платформы устраняют это ограничение, обеспечивая контролируемый непрерывный поток через эндотелиальные монослои во время фазы созревания развития конструкции.

Последние проекты включают в себя несколько параллельных каналов для генерации градиентов кислорода наряду с профилями сдвига, имитируя физиологические микросреды, обнаруженные в нативных дольках печени. Консорциум Liver-on-a-Chip в Университете Пенсильвании разработал устройство с 16 индивидуально адресуемыми синусоидальными каналами, каждый из которых связан с паренхиматозным отсеком, содержащим первичные гепатоциты человека. После семи дней перфузионной культуры эндотелиальные клетки в этих устройствах экспрессируют CD31 и VE-кадгерин на уровнях, сопоставимых с нативной тканью печени, демонстрируя частоты фенестрации, приближающиеся к 85% значений in vivo. Платформа также позволяет в режиме реального времени контролировать секрецию альбумина, производство мочевины и активность фермента CYP450 в качестве показателей функциональности конструкции.

Направленная дифференциация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в синусоидальный эндотелий

Доступность аутологичных клеточных источников остается критическим барьером для клинического перевода конструкций печени. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) предлагают теоретическое решение, но требуют точных протоколов дифференциации для генерации специфических эндотелиальных подтипов, необходимых для образования синусоида. Стандартные протоколы дифференциации производят генерические сосудистые эндотелиальные клетки, в которых отсутствует фенестратный фенотип, характерный для синусоидов печени. Для преодоления этого ограничения исследователи разработали поэтапные протоколы дифференциации, которые включают специфичную для печени фазу первичного введения с использованием Wnt3a, активина A и костного морфогенетического белка 4 (BMP4).

После направления ИПСК через мезодермальный промежуточный продукт клетки подвергаются воздействию фактора роста гепатоцитов (HGF) и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) с добавлением модуляторов сигнализации ретиноевой кислоты. Полученные клетки экспрессируют стабилин-2 и LYVE-1, маркеры, специфичные для синусоидальных эндотелиальных клеток печени (LSEC), которые отсутствуют в стандартных производных эндотелия печени. Недавняя работа в Токийском медицинском и стоматологическом университете продемонстрировала, что эти LSEC, полученные из ИПСК, при семявлении в децеллюляризированные печеночные каркасы, повторно заселяют синусоидоподобные структуры и экспрессируют кавеолин-1 на уровнях, достаточных для поддержки трансцитоза малых молекул. Подход остается ограниченным эффективностью дифференциации - в настоящее время достигает примерно 40-60% чистоты - но продолжающиеся уточнения в составе культуральных сред и времени продолжают улучшать урожайность.

Внеклеточная матричная инженерия для направленной самосборки

Внеклеточный матрикс печени’ обеспечивает не только структурную поддержку, но и биохимические сигналы, которые направляют клеточную организацию. Биоинженерные каркасы, которые повторяют нативную композицию ECM, позволяют эндотелиальным клеткам самоорганизоваться в синусоидные сети, а не требуют полного архитектурного предопределенности. Протеомный анализ децеллюляризованной человеческой печени ECM выявил более 250 уникальных матричных белков, причем коллаген IV, ламинин, фибронектин и перлекан являются наиболее распространенными. Эти белки представляют сайты связывания для интегринов, которые активируют сигнальные пути, способствующие образованию труб и поддержанию фенестрации.

Децеллюляризированные каркасы для цельных печени представляют собой золотой стандарт для подходов на основе ECM, сохраняя нативную сосудистую архитектуру до синусоидального уровня. При пересеянии с первичными LSEC человека и гепатоцитами эти конструкции показывают функциональный сосудистый анастомоз, который поддерживает перфузионное давление в физиологических диапазонах. Лаборатория Отта в Университете Миннесоты дополнительно усовершенствовала этот подход, используя последовательные протоколы децеллюляризации, которые сохраняют содержание гликозаминогликанов, поддерживая секвестрацию фактора роста, которая поддерживает долгосрочную эндотелиальную жизнеспособность. Однако зависимость от донорских органов ограничивает масштабируемость, стимулируя параллельные усилия по созданию синтетических ECM-мимик с использованием электроспуновых нановолоконных сеток, функционализированных с конкретными доменами белка ECM.

Преодоление препятствий в синусоидальной зрелости и стабильности

В то время как каждая из описанных стратегий продемонстрировала перспективность в изоляции, их клинический перевод требует преодоления постоянных проблем, связанных с конструкцией стабильности и долгосрочной функции. Одним из наиболее существенных препятствий является поддержание фенестраций в культивируемых LSEC. В естественных условиях стабильность фенестрации зависит от динамического равновесия, регулируемого реорганизацией актина цитоскелета и сигнализацией ро-киназы. Когда LSEC удаляются из их родной среды и помещаются в культуру, фенестрации быстро снижаются в течение 48-72 часов. Эта потеря фенестрации приводит к нарушению молекулярного транспорта и снижению метаболической функции в основных гепатоцитах.

Фармакологические подходы с использованием симвастатина и других статинов показали частичный успех в сохранении фенестраций путем подавления активности Rho-киназы. Кроме того, кокультура с печеночными звездчатыми клетками оказалась более эффективной, чем любое фармакологическое вмешательство в поддержание плотности фенестрации. Стеллатные клетки секретируют растворимые факторы, включая VEGF-C и ангиопойетин-2, которые активируют рецепторы Tie2 на LSEC, запуская сигнальные каскады, которые стабилизируют фенотип фенестрата. Биоинженерные конструкции, которые включают звездчатые клетки в перизинусоидальное пространство - либо через контролируемую пространственную печать, либо через последовательные протоколы посева - демонстрируют трехкратное улучшение барьерной функции в 14 дней по сравнению с эндотелиальными конструкциями.

Иммунологические соображения для имплантируемых конструкций

Аллоиммунные реакции представляют собой дополнительный барьер для использования LSEC стволовых клеток в биоинженерных конструкциях печени. В то время как аутологичные клетки, полученные из iPSC, теоретически избегают отторжения, высокие затраты и длительные сроки производства ограничивают их практическое применение. Аллогенные подходы с использованием стратегий иммунного маскировки привлекают внимание в качестве альтернативных решений. Инженерные LSEC для экспрессии HLA-E, неклассической молекулы MHC, которая ингибирует активацию естественных клеток-киллеров, обеспечивает один путь для уклонения от иммунитета без системной иммуносупрессии. Доклинические модели у приматов, не являющихся людьми, демонстрируют, что LSEC, разработанные HLA-E, выживают более 30 дней после имплантации без признаков NK-опосредованного отторжения.

Криоконсервация этих клеток в иммунной оболочке остается сложной задачей, поскольку циклы замораживания-оттаивания снижают плотность фенестрации примерно на 40% в текущих протоколах. Исследовательские группы в нескольких учреждениях изучают методы витрификации, которые включают трегалозу и другие криопротекторы для повышения жизнеспособности после оттаивания LSEC. Успешная разработка протокола криоконсервации позволит обеспечить готовую доступность синусоидальных эндотелиальных компонентов, резко уменьшая логистические барьеры для биоинженерии тканей печени в клиническом масштабе.

Синергетические платформы и новые направления

Наиболее многообещающие последние достижения появились из стратегий, которые сочетают в себе несколько биоинженерных подходов в рамках унифицированных платформ. Гибридные системы, интегрирующие 3D-биопечать с микрофлюидной перфузией, представляют собой особенно активную область исследования. В этих платформах печатные структурные элементы обеспечивают архитектурную основу, в то время как микрофлюидные каналы обеспечивают условия потока, необходимые для созревания эндотелия. Доклинические данные из совместного исследования MIT и Венского медицинского университета ] демонстрируют, что гибридные конструкции поддерживают производство альбумина на 60% от родного уровня печени в течение 28 дней в культуре, что в три раза лучше, чем статические биопечатные конструкции без перфузии.

Органоидные подходы предлагают комплементарную стратегию, используя присущую плюрипотентным стволовым клеткам способность к самоорганизации для генерации структур почек печени, содержащих функциональные синусоиды. Эти органоиды развиваются, когда iPSC совместно культивируются с эндотелиальными клетками пуповинной вены человека и мезенхимальными стволовыми клетками, приводя к спонтанной самоорганизации в многоклеточные агрегаты. В течение 48 часов эндотелиальные клетки в этих агрегатах образуют CD31-позитивные сетевые структуры, которые реагируют на ингибирование VEGF, подтверждая наличие активной ангиогенной сигнализации. В то время как современные органоиды достигают диаметров всего 1-5 миллиметров из-за ограничений диффузии, комбинируя органоидную технологию с протоколами интеграции микроваскулатуры, могут позволить васкуляризированную сборку клинически значимых тканевых масс.

In Vivo Engineering и переходные строительные леса

Альтернативная парадигма, набирающая тягу, включает в себя in vivo тканевую инженерию, где децеллюляризированные каркасы или синтетические конструкции имплантируются с ожиданием, что собственные клетки реципиента & #8217 будут васкуляризировать и реконструировать структуру. эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFC), циркулирующие в периферической крови, были использованы для этой цели. Когда биоинженерные печеночные конструкции имплантируются внутрипечено в модели грызунов, хозяин-производные ECFC проникают в каркас в течение 72 часов и начинают формировать химерные синусоиды с донорскими LSEC. Эти гибридные сосуды демонстрируют барьерную функцию и поддерживают модели фенестрации, подобные нативным синусоидам, через 14 дней после имплантации.

Использование разлагаемых каркасов, которые постепенно резорбируются в качестве ремоделирования тканей хозяина, дает дополнительные преимущества для клинического перевода. Эскафоты поликапролактона (PCL), покрытые гепаринсвязывающими факторами роста, поддерживают сосудистое вторжение хозяина при сохранении механической целостности в течение 6-8 недель до начала деградации. Это временное окно позволяет полностью васкуляризировать конструкцию до переноса нагрузки каркаса на вновь сформированный внеклеточный матрикс. Клинические данные из связанных с ними приложений для сердечной тканевой инженерии показывают, что этот подход поддерживает функциональный анастомоз с сосудистой системой реципиента посредством процессов, связанных с ремоделированием матриксовой металлопротеиназы и стабильной интеграцией.

Путь к клиническому переводу

Путь от доклинического успеха до клинического применения биоинженерных конструкций печени требует преодоления проблем регулирования, производства и возмещения, которые параллельны техническим препятствиям. Руководство Управления по контролю за продуктами и лекарствами США & #8217 классифицирует инженерную печеночную ткань как комбинированный продукт, требуя координации между Центром оценки и исследований биологических препаратов и Центром устройств и радиологического здоровья. Успешная навигация этой нормативной базы потребует всесторонней демонстрации как безопасности, так и функциональной пользы на крупных моделях животных до начала клинических испытаний на людях.

Масштабируемость производства представляет собой не менее важную задачу. Предполагаемая потребность клеток в клинически релевантном биоинженерном пластыре печени, способном поддерживать 10-15% нативной функции печени, составляет примерно 5 миллиардов гепатоцитов и 2 миллиарда LSEC. Текущая хорошая производственная практика (GMP) может производить эти цифры из iPSC, но стоимость в настоящее время превышает 500 000 долларов США за одну дозу пациента. Автоматизация протоколов дифференциации и систем биореакторов, которые поддерживают параллельные производственные кампании, будет иметь важное значение для снижения затрат до экономически жизнеспособных уровней. Несколько организаций по разработке контрактов в настоящее время инвестируют в биореакторы замкнутой системы, которые интегрируют дифференцировку, созревание и сборку в рамках единого автоматизированного рабочего процесса.

Несмотря на эти проблемы, траектория поля указывает на значимое клиническое воздействие в течение следующего десятилетия. Сближение передовых биопечати, микрофлюидного кондиционирования, биологии стволовых клеток и ECM-инжиниринга создало конструкции, которые повторяют синусоидальную структуру и функцию с беспрецедентной точностью. Каждое постепенное улучшение стабильности фенестрации, управления потоком или клеточной идентичности приближает биоинженерную печень к клинической реальности. Для пациентов, ожидающих трансплантации печени, которые в настоящее время сталкиваются со средним временем ожидания, превышающим 300 дней, эти инновации предлагают ощутимый и ускоряющийся путь к альтернативным решениям. Интеграция этих подходов в рамках унифицированных производственных платформ в конечном итоге определит, выполняют ли биоинженерные ткани печени свой потенциал в качестве трансформационной терапии для конечной стадии заболевания печени.