Использование изотопной маркировки для элюквидации механизмов реакции и законов ставок

Раскрытие разрыва и формирования облигаций

Рассмотрим реакцию замещения, в которой разрывается углерод-галогенная связь и образуется новая углерод-кислородная связь. Если галоген помечается радиоактивным изотопом (например, ^]36Cl), наличие радиоактивности в уходящей группе подтверждает, что углерод-галогенная связь разрывается. И наоборот, если кислород в нуклеофиле помечается ¹⁸O, обнаружение ¹⁸O в продукте проверяет новую связь. В более сложных перегруппировках, таких как сдвиг Вагнера-Меервейна или перегруппировка Бекмана, маркировка может идентифицировать, какой атом углерода или азота мигрирует.

Классическим примером является SN1 против SN2 механистическая дискуссия. В реакции SN2 маркировка углеродного центра ¹³C и нуклеофила ¹⁸O может показать, что нуклеофил присоединяется на противоположной стороне уходящей группы (инверсия). В SN1 происходит рацемизация, и паттерны маркировки могут различать, является ли промежуточный карбокационный элемент свободным или ионно-парным. Современные методы, такие как изотопные кроссоверные эксперименты — с использованием двух разных меченых реагентов — могут доказать, свободны ли промежуточные вещества или остаются связанными с катализатором.

Отслеживание миграции атомов в переустройстве

Изотопная маркировка особенно эффективна для перестановок, где разрываются и образуются множественные связи. Например, перегруппировка pinacol включает миграцию метиловой группы. Наклеймив одну метиловую группу ¹³C, химики могут определить, мигрирует ли метиловая группа в виде карбокации или через согласованный механизм. Расположение ¹³C в конечном кетоне напрямую сообщает о пути миграции.

В Beckmann перегруппировка , маркировка оксимного азота с ¹⁵N и мигрирующей алкильной группы с ¹³C показали, что азот-кислородная связь расщепляется до перемещения алкильной группы. Такая информация имеет решающее значение для проектирования катализаторов и понимания реактивности.

Исследования механизма фермента

Ферменты катализируют реакции с изысканной селективностью, а изотопная маркировка является основой ферментологии. Маркировка дейтерия часто используется для исследования того, является ли стадия переноса протона скоростной. Например, в алкогольной дегидрогеназе замена алкогольной подложки на дейтератированную версию резко замедляет реакцию, подтверждая, что перенос гидрида является медленной стадией. Аналогично, маркировка оксигена-18 воды или фосфата может идентифицировать источник атомов кислорода в реакциях гидролиза или переноса фосфорила.

Сайт-направленный мутагенез в сочетании с изотопной маркировкой позволяет исследователям точно определить роль специфических аминокислотных остатков.Если мутация нарушает ключевую водородную связь, кинетическое изотопное действие изменяется, обеспечивая карту архитектуры активного сайта.

Разгадывание многошаговых каталитических циклов

В гомогенном катализе, таком как реакции перекрестного соединения (например, Suzuki, Heck, Negishi), маркировка изотопов помогает идентифицировать этап ограничения оборота. Например, размещение ¹³C в ipso положении арильного галогенида может выявить, определяет ли окислительное сложение, трансметаллирование или редуктивное удаление общую скорость. Сравнивая соотношение ¹³C/¹²C в продукте по сравнению с исходным материалом в различных условиях, химики могут вывести механизм и оптимизировать конструкцию катализатора.

Кинетические изотопные эффекты и законы скорости

кинетический изотопный эффект (KIE) — это изменение скорости реакции, когда атом заменяется его изотопом. Величина KIE зависит от того, участвует ли изотоп непосредственно в стадии определения скорости. Для первичного изотопного эффекта (связь с изотопом нарушается или образуется на стадии определения скорости) kk_HkD_D типично находится между 2 и 7 при комнатной температуре.¹²C/¹³C эффект меньше (1.01—1.06), но может быть измерен с высокой точностью с использованием масс-спектрометрии.

Вторичные изотопные эффекты возникают, когда изотопная замена находится в связи, прилегающей к реакционному центру. Эти эффекты меньше (обычно k_H/k_D ≈ 0,8-1,2) и отражают изменения в гибридизации или гиперконъюгации. Инверсивные изотопные эффекты (k_{/kD<1) могут возникнуть, если изотопная связь становится более жесткой в переходном состоянии.}

Определить закон ставок с помощью KIE

Законы скорости выражают, как скорость реакции зависит от концентраций реагентов. Маркировка изотопов помогает определить, какой реагент участвует в стадии определения скорости. Если реакция показывает большой первичный КПЭ, когда конкретный водород заменяется дейтерием, то водород должен быть вовлечен в событие, ограничивающее скорость разрыва связи или образования связи. И наоборот, ничтожно малый КПЭ предполагает, что шаг является быстрым по сравнению с другими шагами.

Например, в реакции элиминации E2 закон скорости обычно является вторым порядком: скорость = k[основа][алкилгалоид]. Если алкилгалид содержит дейтерий на стадии β-углерода, значительный первичный KIE подтверждает, что связь C-H(D) нарушена на стадии определения скорости. Если KIE мала, реакция может протекать через механизм E1, где уходящая группа уходит первой. Эти эксперименты были решающими в различении путей элиминации.

Конкурентные и неконкурентные измерения KIE

Экспериментальные подходы являются общими:

• Внутримолекулярная конкуренция — субстрат с двумя эквивалентными положениями, одно помечено и одно немаркировано, допускается к реакции. Соотношение продукта непосредственно дает KIE. Этот метод очень точен, поскольку он устраняет межмолекулярные вариации.
• Межмолекулярная конкуренция — две отдельные реакции, одна с немаркированной подложкой и одна с меченой подложкой, протекают в одинаковых условиях. Соотношение констант скорости получается из начальных скоростей или из выходов продукта в конкурентном эксперименте (например, с использованием смеси меченой и немаркированной подложки и анализом продуктов масс-спектрометрией).

В последние годы высокоточная масс-спектрометрия изотопного отношения (IRMS) позволила измерить эффекты изотопов естественного изотопа, устраняя необходимость в синтетической маркировке в некоторых случаях. Например, соотношение ¹³C/¹²C в бензойной кислоте может выявить механизм ее образования от окисления толуола.

Изотопная ловля и промежуточное обнаружение

В сложных многоступенчатых реакциях предлагаемый промежуточный продукт может быть слишком коротким для обнаружения непосредственно. Изотопное улавливание включает добавление меченого падальщика, который реагирует с промежуточным продуктом, чтобы сформировать стабильный продукт. Наличие метки в захваченном продукте подтверждает существование промежуточного продукта. Например, в биосинтезе многих натуральных продуктов, ¹³C-маркированные предшественники подаются организмам, и изотопное обогащение в изолированных промежуточных продуктах измеряется ЯМР.

Практические соображения и ограничения

Хотя маркировка изотопов является мощным инструментом, она имеет ограничения и требует тщательного экспериментального проектирования.

• Изотопная чистота — коммерчески доступные маркированные соединения обычно имеют 99% или более изотопное обогащение.Даже небольшие примеси могут искажать результаты в конкурентных экспериментах.
• Масштабируемость и стоимость — некоторые изотопологи, такие как ¹³ C- меченные аминокислоты или ¹⁵N- меченные нуклеотиды, являются дорогостоящими. Синтез специально меченных соединений может быть сложным и трудоемким.
• Аналитическая чувствительность — для обнаружения небольших изотопных сдвигов в больших молекулах требуется масс-спектрометрия высокого разрешения или криозондная ЯМР. Для изотопов с низким изотопом, таких как ¹⁵N, требуется длительное время получения.
• Пещера с большими KIE — большой первичный KIE является убедительным доказательством расщепления связи на стадии определения скорости, но небольшой KIE не исключает такого расщепления, если переходное состояние является очень несимметричным или если эффекты туннелирования значительны.
• Солевентные эффекты — в протических растворителях водородный обмен может скремблировать метки. Например, дейтерий на обмениваемом участке (например, O-D, N-D) может быстро уравновешивать с растворителем, заслоняя исходное положение метки.

Несмотря на эти трудности, маркировка изотопов остается одним из наиболее надежных методов установления механизмов реакции. Она часто дает первые прямые доказательства в пользу или против предлагаемого пути.

Современные приложения и новые тенденции

Метаболизм лекарственных средств и фармакокинетика

Фармацевтические компании регулярно используют маркировку изотопов для изучения метаболизма лекарственных средств. Заменяя водород дейтерием или ¹⁴C в кандидате на препарат, исследователи могут отслеживать его поглощение, распределение, метаболизм и экскрецию (ADME) на животных моделях и людях. Стабильные внутренние стандарты с изотопной маркировкой необходимы для количественных анализов LC-MS/MS в клинических испытаниях. Кроме того, модификация дейтерия в настоящее время является стратегией для улучшения свойств лекарств: дейтерия может замедлить метаболический клиренс, воздействуя на кинетику расщепления связи C-H ферментами цитохрома P450. Первый дейтератный препарат, дейтетрабеназин, был одобрен в 2017 году для болезни Хантингтона, и многие другие находятся в разработке.