Использование микродиссекции лазерной пленки для выделения определенных клеток в культуре

Введение: необходимость точности в клеточной биологии

Современная биология все больше требует способности изучать клетки не как усредненные популяции, а как отдельные игроки в сложных системах. Независимо от того, исследуют ли генетические драйверы опухоли, расшифровывают ли нейронные цепи мозга или понимают, как различаются стволовые клетки, исследователи требуют методов для изоляции конкретных типов клеток с хирургической точностью. Лазерная захватная микродиссекция (LCM) появилась как мощная лазерная техника, которая позволяет селективное извлечение целевых клеток непосредственно из гетерогенных участков ткани или клеточных культур. Объединив микроскопическую визуализацию с сфокусированным лазером, LCM обеспечивает прямой путь к получению чистых клеточных популяций для последующего молекулярного анализа, включая секвенирование ДНК, профилирование РНК и протеомику.

В этой статье представлен всеобъемлющий технический обзор LCM, от его фундаментальных принципов и пошагового рабочего процесса до его разнообразных применений, общих проблем и новых инноваций. Написанный для исследователей и специалистов лаборатории, контент подчеркивает практические стратегии для достижения высококачественной изоляции клеток без загрязнения.

Что такое микродиссекция лазерной захватной пленки?

Лазерная микродиссекция захвата (LCM) - это бесконтактная, микроскопическая технология, которая использует лазер для разрезания и выделения конкретных клеток или групп клеток из образца твердой ткани или культивированного монослоя клеток. Метод был впервые разработан в середине 1990-х годов в Национальном институте здравоохранения, в первую очередь для удовлетворения потребности в чистых популяциях клеток в геномике рака. С тех пор он был усовершенствован и коммерциализирован несколькими производителями, став краеугольным камнем пространственной биологии и одноклеточного анализа рабочих процессов.

Принцип ядра удивительно прост: витражный гистологический участок или чашка культивируемых клеток помещаются на стадию специализированного перевернутого микроскопа. Оператор просматривает образец, идентифицирует интересующие клетки на основе морфологии, гистохимического окрашивания или флуоресцентных маркеров, а затем использует управляемый компьютером лазер для разрезания вокруг этих клеток. Затем изолированный материал собирается в трубку для экстракции нуклеиновых кислот, белков или метаболитов. LCM отличается от проточной цитометрии или лазерного захвата без разреза — он сохраняет пространственную архитектуру ткани и позволяет извлекать клетки в их родной микросреде.

Ключевые характеристики LCM включают:

Высокое пространственное разрешение: Может изолировать одиночные клетки или небольшие группы.
Минимальное сопутствующее повреждение: Энергия лазера точно сфокусирована, уменьшая тепловое повреждение соседних клеток.
Визуальное руководство: Морфология и специфический выбор клеток для окрашивания.
Совместимость с анализами ниже по течению: Собранный материал работает с ПЦР, микрочипами, РНК-секом и масс-спектрометрией.

Рабочий процесс LCM: пошаговое руководство

Успешная LCM требует тщательного внимания к каждой фазе рабочего процесса, от подготовки образца до сбора. Ниже приводится подробная разбивка стандартной процедуры.

1. Подготовка и фиксация образцов

Сохранение клеточной архитектуры и молекулярного содержания имеет первостепенное значение. Большинство протоколов рекомендуют флэш-замороженную ткань , встроенную в соединение с оптимальной температурой резки (OCT), секционируемое при толщине 5-10 мкм и установленное на специальных мембранных слайдах (например, слайдах с мембраной PEN или PET мембранами). Для клеточных культур клетки выращивают непосредственно на мембранных слайдах или на покровных слайдах, которые могут быть перенесены на слайд. Фиксация обычно выполняется с ледяным ацетоном, этанолом или метанолом. Фиксация формалина избегает для исследований РНК, потому что она сшивает нуклеиновые кислоты и разлагает РНК, но для анализа ДНК и белка может использоваться легкая формалиновая фиксация с последующей тщательной обработкой.

2.Окрашивание для визуализации

Для идентификации интересующих клеток секция окрашена. Гематоксилин и эозин (H&E) являются наиболее распространенным пятном для идентификации на основе морфологии, но для нацеливания на специфические белковые маркеры может использоваться иммуногистохимия (IHC) или иммунофлуоресценция (IF). Окрашивание должно быть сделано быстро и в условиях без RNase, если РНК необходимо извлечь. Протоколы Rapid H&E (0,5-1 минута в гематоксилине, затем эозин) являются стандартными. После окрашивания слайд обезвоживается через градуированные этанолы и очищается в ксилоле для удаления воды, что будет препятствовать поглощению энергии лазером.

3. Микроскопия и выбор целей

Слайд размещается на стадии микроскопа системы LCM. Оператор использует цифровую камеру высокого разрешения и программный интерфейс для сканирования образца. Используя яркополевую или флуоресцентную визуализацию, клетки, соответствующие заранее заданным критериям (например, Ki-67-позитивные, GFAP-позитивные или клетки с атипичными ядрами), выбираются путем рисования интересующих областей на экране. Современные системы позволяют автоматизировать выбор на основе цветовых порогов или алгоритмов машинного обучения.

4. Лазерная резка (разрез)

Используются две первичные лазерные технологии: УФ (ультрафиолет) резка лазеров и ИР (инфракрасный) захват лазеров. УФ-лазеры (355 нм) сужают узкий путь вокруг выбранных клеток, прорезая ткань и мембрану. Лазер сканируется вдоль определенного полигона, и разрезанные клетки остаются прикрепленными к слайду гравитацией. ИК-лазеры (например, 800 нм) расплавляют термопластичную клейкую пленку, которая помещается поверх ткани — клетки прилипают к пленке при запуске лазера. Некоторые системы объединяют оба: УФ для резки и ИК для захвата.

5. Сбор изолированных клеток

Методы сбора расчлененных клеток варьируются в зависимости от системы.

Лазерная катапультировка под давлением (LPC): Короткий высокоэнергетический лазерный импульс поднимает разрезанный кусок ткани в воздух, где он захватывается крышкой трубки, покрытой клеем или заполненной буфером.
Захват клейкой крышки: После разрезания крышка с клеевым материалом нажимается на образец и снимается, забирая срезанные ячейки.
Гравитационное падение: Кусок среза попадает в трубку, расположенную ниже стадии.

Собранный материал немедленно помещают в буфер лизиса или экстракционную среду для сохранения молекулярной целостности.

Типы систем LCM

Понимание различий между платформами LCM помогает исследователям выбрать лучший подход для их конкретного применения.

Feature	UV Laser Cutting	IR Laser Capture
Laser type	Pulsed UV (355 nm)	Continuous IR (800 nm)
Mechanism	Photoablation (cuts tissue)	Thermal adhesion to film
Resolution	Single cell possible	Typically groups of cells
Speed	Fast	Fast (capture step)
Sample type	Thin sections, membranes	Thick sections possible
RNA preservation	Excellent (no heat)	Good (brief heat pulse)

Популярные коммерческие системы включают Carl Zeiss PALM MicroBeam (на основе LPC, УФ-резка), Leica LMD6 / LMD7 (УФ-резка, гравитационная коллекция) и ArcturusXT (комбинированная ИК- и УФ-схема).

Ключевые приложения в биологических исследованиях

LCM сыграла важную роль в продвижении многочисленных областей. Ниже приведены репрезентативные примеры, имеющие реальное значение.

Геномика рака и неоднородность опухоли

Твердые опухоли представляют собой мозаику злокачественных клеток, стромальных клеток, иммунных клеток и сосудистой системы. Секвенирование навалом может маскировать критические мутации драйверов, присутствующие только в субклоне. LCM позволяет изолировать чистые опухолевые клетки от конкретных областей (например, инвазивный фронт, некротические ядра или перисосудистые ниши). Например, LCM использовался для сравнения мутаций в первичных опухолях молочной железы с соответствующими метастазами лимфатических узлов, выявляя закономерности эволюции лимфатических узлов. Он также имеет решающее значение для пространственной транскриптомики , где экспрессия генов в микроокружении опухоли отображается по регионам. (Узнать больше о пространственных подходах на странице Природная пространственная транскриптомика.

Нейронаука: декодирование нейронных цепей

Мозг содержит сотни типов клеток, перемешанных в микроскопических масштабах. LCM позволяет исследователям изолировать конкретные нейроны, экспрессирующие конкретный маркер (например, тирозингидроксилазу в дофаминергических нейронах) из замороженных секций. Это позволило профилировать экспрессию генов в нейронах субстанции нигры болезни Паркинсона или идентифицировать уникальные нейронные подтипы в коре. Комбинирование LCM с одноклеточной РНК-сек обеспечило глубокое понимание механизмов нейродегенеративных заболеваний.

Биология развития и исследования стволовых клеток

Во время эмбриогенеза клетки подвергаются быстрым изменениям судьбы в дискретных пространственных доменах. LCM использовался для изоляции нейронного гребня, нотохорда или почки конечностей от ранних эмбрионов для изучения стадийно-специфических транскрипционных программ. В культурах стволовых клеток LCM может изолировать морфологически различные колонии (например, плюрипотентные против дифференцированных) для сравнительного анализа без необходимости FACS, который может стрессировать клетки.

Судебно-археологический анализ ДНК

LCM становится инструментом в судебной генетике для сбора очень небольшого количества клеток (например, из образцов сенсорной ДНК или сперматозоидов из смешанных пятен) для профилирования ниже по течению короткого тандемного повторения (STR). Он также применяется в палеогеномике для выделения конкретных типов клеток из мумифицированных или консервированных тканей, сводя к минимуму загрязнение от микробов окружающей среды.

Преодоление общих проблем в LCM

Несмотря на свою мощь, LCM требует тщательной оптимизации.Следующие проблемы часто встречаются и могут быть смягчены с помощью надлежащих протоколов.

Целостность РНК и загрязнение RNase

Для поддержания целостности РНК все реагенты и слайды должны быть без RNase. Работайте в среде без RNase, используйте воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (DEPC), и сохраняйте образцы холодными во время резки (используйте холодную стадию). Общей метрикой является номер целостности РНК (RIN); LCM-образцы должны в идеале иметь RIN > 7. Протоколы быстрого окрашивания (до 5 минут) и немедленный сбор в сильный денатурант (например, гуанидинийтиоцианат) имеют решающее значение.

Загрязнение окружающих клеток

Поскольку LCM является визуальным, риск включения нежелательных клеток является самым высоким вдоль границы разреза. Чтобы минимизировать загрязнение, проведите путь разреза с отрывом 5-10 мкм от целевых клеток, когда это возможно. Для очень редких популяций двухэтапный подход (сначала разрезайте большую область, затем разрезайте чистое ядро) может улучшить чистоту. Всегда проверяйте чистоту микроскопическим осмотром захваченного материала или анализом небольшой аликвоты с ПЦР для маркеров нецелевых клеток.

Количество ограничений в выборке

LCM дает очень небольшое количество материала — часто всего несколько сотен клеток или даже одна клетка. Для РНК требуются высокочувствительные методы нисходящего потока. Для РНК используют этапы предварительной амплификации (например, методы линейной амплификации или методы на основе ПЦР), но следует помнить о смещении. Для белков необходимы методы амплификации сигнала (например, амплификации сигнала тирамида) или микромасштабная масс-спектрометрия. Планирование вперед и объединение нескольких захватов может помочь, но будьте осторожны при объединении в разных регионах, если важна пространственная информация.

Лучшие практики для успешного LCM

Основываясь на опыте многих лабораторий, следующие рекомендации повышают показатели успеха:

Оптимизируйте толщину сечения: 5-7 мкм для РНК, 7-10 мкм для ДНК/белка. Более толстые секции плохо сокращаются и рискуют деградацией РНК.
Используют мембранные слайды: Полиэтилен нафталатные (PEN) мембраны обеспечивают чистый разрез с минимальным количеством мусора.
Сохраняйте образцы холодными: Сокращение при температуре -20°C стадии для подавления активности RNase.
Ограничить время окрашивания: Быстрое H&E или использовать кресилфиолетовый (0,5% в течение 30 секунд) для минимизации молекулярной потери.
Использовать отрицательные элементы управления: Включать захват только буфера и захват области без клеток для проверки на загрязнение.
Калибровочный лазер ежедневно: Лазерная мощность, фокусировка и скорость резания нуждаются в корректировке для каждого типа образца.

Подробную справку по протоколу см. в LCM-протоколе на Protocol Exchange.

Будущие направления и инновации

Область микродиссекции лазерного захвата быстро развивается, что обусловлено интеграцией передовых технологий.

Интеграция с одноклеточной и пространственной омикой

Платформы секвенирования следующего поколения теперь позволяют проводить транскриптомный анализ отдельных клеток, захваченных LCM. Связывание LCM с обратной транскрипцией в микрофлюидном или нанолитровом масштабе позволяет выполнять транскриптомику с пространственным разрешением. Аналогично, LCM сочетается с масс-спектрометрической визуализацией (MSI) для предоставления как протеомных, так и метаболомных данных из одного и того же участка ткани.

Автоматизация и машинное обучение

Ручное выделение ячеек занимает много времени. Новое программное обеспечение включает машинное обучение для автоматической идентификации типов ячеек на основе ядерной морфологии или интенсивности окрашивания. Эти алгоритмы могут отслеживать границы ячеек и планировать оптимальные пути разреза, увеличивая пропускную способность и воспроизводимость. Автоматизированное движение сцены позволяет без присмотра несколько захватов с одного и того же слайда.

Live-Cell LCM

Традиционно LCM выполняется на фиксированных или замороженных образцах. Последние инновации позволяют захватывать живые клетки из культуральных блюд с помощью маломощного ИК-лазера для мягкого прикрепления клеток к пленке, которые затем культивируются или анализируются. Это имеет потенциал для исследований клонального расширения и тестирования лекарств на чистых клеточных популяциях.

Мультимодальный LCM

Комбинирование LCM с другими методами микроскопии (например, рамановская спектроскопия или мультифотонная микроскопия) позволяет отбирать на основе химических или структурных характеристик без окрашивания, сохраняя нативное молекулярное состояние. Это особенно ценно для деликатных образцов, таких как ткани растений или архивный материал.

Эти инновации подробно описаны в последних обзорах, таких как , полное резюме приложений LCM в исследованиях рака, опубликованное в PMC .

Заключение

Лазерная микродиссекция остается незаменимым инструментом для изоляции конкретных клеток из гетерогенных образцов. Ее способность сочетать морфологическое руководство с точным, без загрязнения извлечением открыла открытия в геномике рака, нейронауке и за ее пределами. В то время как такие проблемы, как сохранение РНК и низкие выходы, требуют тщательной оптимизации протокола, техника продолжает созревать, с автоматизацией и пространственной омической интеграцией, расширяющей ее полезность. Для любого исследователя, нуждающегося в расчленении клеточной гетерогенности с пространственным контекстом, LCM предлагает прямой и мощный подход. Принятие лучших практик, изложенных здесь, максимизирует качество захваченного материала и надежность анализа ниже по течению, гарантируя, что биологический сигнал интереса не теряется среди шума смешанных популяций.