Использование микроканалов на основе гидрогеля для формирования сосудистой сети

Последние достижения в тканевой инженерии подчеркнули потенциал микроканалов на основе гидрогеля для руководства формированием сосудистых сетей. Эти микроканалы воспроизводят геометрию и масштаб естественных капилляров, позволяя доставлять питательные вещества и кислород глубоко в инженерные конструкции тканей. Предоставляя физический шаблон для выравнивания эндотелиальных клеток и образования просвета, микроканалы гидрогеля решают одно из самых стойких узких мест в регенеративной медицине: неспособность васкуляризировать толстые тканевые трансплантаты. В этой статье рассматривается проектирование, изготовление и биологическая производительность микроканалов на основе гидрогеля и исследуется, как они развертываются для создания функциональной сосудистой системы in vitro и in vivo .

Введение в микроканалы Hydrogel

Гидрогели представляют собой сшитые полимерные сети, которые сохраняют большие объемы воды, как правило, 90-99 % от их общего веса. Их высокое содержание воды, механическое сходство с мягкими тканями и настраиваемые биохимические свойства делают их привлекательными каркасами для клеточной культуры и тканевой инженерии. Когда микроканалы, диаметром от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, встроены в эти гидрогели, они действуют как каналы, имитирующие иерархическую структуру микрососудистой системы. Основная функция этих каналов заключается в обеспечении управляемого пути для эндотелиальных клеток, чтобы организовать в патентованные, прочные сосуды.

В отличие от случайных пористых каркасов, микроканальные гидрогели предлагают детерминированный контроль над сосудистой архитектурой. Это важно, потому что эффективность массового транспорта в тканях зависит от геометрического расположения сосудистой сети. Посредством инженерного диаметра канала, расстояния, углов разветвления и связи исследователи могут оптимизировать эффективность перфузии и имитировать градиенты кислорода, найденные in vivo . Кроме того, гидрогелевая матрица может быть функционализирована с помощью клеевых пептидов, факторов роста или компонентов внеклеточного матрикса (ECM) для содействия прикреплению и дифференцировке клеток, превращая микроканал в биоактивную микросреду, которая активно направляет формирование сосудов.

Техника изготовления

Для создания гидрогелевых микроканалов используется несколько устоявшихся и новых методов.Каждый метод предлагает различные преимущества с точки зрения разрешения, масштабируемости, совместимости материалов и простоты интеграции с другими компонентами. Выбор подхода к изготовлению зависит от конкретных требований модели ткани, включая размер канала, сложность рисунка и тип используемого гидрогеля.

фотолитография

Фотолитография, адаптированная от полупроводникового производства, использует фотомаски и УФ-свет для сшивания конкретных областей фоточувствительного предшественника гидрогеля. Путем выборочного воздействия материала, узоры сшитого гидрогеля и несшитого предшественника (позже смытые) образуют микроканалы. Этот метод дает каналы с высоким разрешением (до ~5 мкм) с четко определенной геометрией. Общие фоточувствительные гидрогели включают диакрилат поли(этиленгликоль) и метакрилат желатина (GelMA). Ключевым преимуществом является способность создавать несколько слоев, что позволяет создавать разветвленные или многоуровневые сети каналов. Однако традиционная фотолитография ограничена плоской геометрией и может потребовать сложного выравнивания для трехмерных конструкций.

3D биопечать

Трехмерная биопечать откладывается клеточными гидрогелями послойным способом для построения микроканальных каркасов. Экструзионная печать может генерировать непрерывные каналы путем печати жертвенных опор или с помощью коаксиальных сопл, которые создают оболочку-и-ядро структуры. После печати жертвенный компонент (например, Pluronic F127, желатин или альгинат) удаляется, чтобы оставить полые каналы. Инъекционная и лазерная биопечать предлагают более высокое разрешение, но более низкую пропускную способность. Основным преимуществом биопечати является ее способность производить сложные, специфичные для пациента сосудистые геометрии, которые соответствуют архитектуре целевого органа. Кроме того, несколько типов клеток могут быть напечатаны одновременно в стенках канала, что позволяет совместной культуре эндотелиальных клеток и поддерживающих фресочных клеток. Исследования показали, что биопечатные микроканалы могут быть перфузированы и оставаться патентованными в течение нескольких недель, поддерживая образование эндотелиального монослоя.

Микроформование

Микроформование включает в себя литье предшественника гидрогеля вокруг предварительно изготовленной формы, затем удаление формы, чтобы оставить полые каналы. Плесень может быть изготовлена из фоторезистивных, силиконовых или растворимых материалов, таких как желатин или сахар. Мягкая литография с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) штампов является распространенным вариантом: мастер PDMS с желаемой топографией канала используется в качестве отрицательного шаблона, а гидрогель наливается на него, отверждается и отслаивается. Этот метод прост, экономичен и совместим со многими гидрогелевыми составами. Однако он в первую очередь подходит для двумерных или мелких трехмерных узоров, а размеры канала ограничены разрешением формы (обычно > 20 мкм). Последние адаптации объединили микроформование со штабелированием для создания более объемных сетей.

Лазерная абляция

Лазерная абляция использует сфокусированные лазерные импульсы для локального удаления гидрогелевого материала, формируя каналы после того, как каркас уже изготовлен. Фемтосекундные лазеры позволяют выполнять субклеточную точность (<1 мкм) и трехмерное написание без необходимости жертвенных слоев. Процесс неконтактный и может применяться к гидрогелям, которые уже нагружены клетками, что делает его универсальным инструментом для интеграции микроканалов в уже существующие конструкции. Основными недостатками являются медленная скорость (точка за точкой сканирования) и потенциальное тепловое повреждение гидрогеля и близлежащих клеток. Тем не менее, лазерная абляция успешно используется для создания перфузионных микроканалов в коллагене, матригеле и синтетических гидрогелях для исследований ангиогенеза.

Новые методы

Жертвенное раскачивание получило тягу как метод создания сложных, взаимосвязанных сетей. Такие материалы, как углеводное стекло, альгинатные волокна или желатиновые нити, печатаются или вплетаются в решетку, встраиваются в гидрогель, а затем растворяются, чтобы оставить полые каналы. Этот подход может генерировать иерархические ветвящиеся структуры, аналогичные иерархии артериол-капилляр-венул. Другой возникающий метод включает использование микрофлюидных устройств, которые непосредственно формируют каналы во время гидрогелевого образования: жидкий предшественник протекает через микрофлюидный канал и сшивается, что дает трубчатую структуру, которая позже может быть выпущена. Электроспиннинг также может производить выровненные нановолокна, которые в сочетании с жертвенными элементами образуют микроканалы с высокими соотношениями поверхности к объему. Эти методы раздвигают границы сложности канала и разрешения.

Роль в формировании сосудистой сети

Руководящая организация эндотелиальных клеток

Первичная роль гидрогелевых микроканалов заключается в обеспечении физического сигнала, который направляет эндотелиальные клетки для выравнивания и формирования трубчатых структур. При засеянии в каналы эндотелиальные клетки прилипают к стенкам канала, размножаются и мигрируют по оси. Геометрия удержания способствует образованию монослоев, которые впоследствии подвергаются люменогенезу - процессу создания центрального, полого просвета. Исследования с использованием временной микроскопии показали, что в течение 24-72 часов эндотелиальные клетки в микроканалах диаметром 50-200 мкм реорганизуются в непрерывные, патентные люмены. Наличие потока (статической среды или перфузии) дополнительно усиливает выравнивание и созревание, налагая напряжение сдвига, которое модулирует экспрессию генов и цитоскелетное ремоделирование.

Обеспечение питательного и кислородного транспорта

Одним из фундаментальных пределов в инженерных тканях является диффузионное расстояние кислорода — обычно 100—200 мкм. Без сосудистой сети клетки в толстых конструкциях становятся гипоксическими и некротическими. Микроканалы преодолевают это, обеспечивая конвективный транспорт, доставляя кислород и питательные вещества по всему каркасу. Вычислительные модели подтверждают, что сеть микроканалов, разнесенных на 200—400 мкм друг от друга, может поддерживать физиологические уровни кислорода даже в конструкциях толщиной в несколько миллиметров. Эксперименты с гидрогелевыми микроканалами, перфузированными культуральной средой, продемонстрировали устойчивую жизнеспособность гепатоцитов, кардиомиоцитов и стволовых клеток в течение нескольких недель. Кроме того, каналы могут быть подключены к внешним насосам или микрофлюидным контроллерам для имитации пульсативного кровотока, что еще больше улучшает массовый транспорт.

Интеграция с принимающей васкулатурой

Для применения in vivo, спроектированные микроканалы должны не только поддерживать рост клеток, но и соединяться с кровеносной системой хозяина. Было показано, что предваскуляризированные гидрогелевые имплантаты, содержащие эндотелиальные клеточные микроканалы, анастомозируются с сосудами-хозяевами в течение нескольких дней после имплантации. Эта быстрая интеграция обусловлена ростом капилляров хозяина в имплантат и прорастанием эндотелиальных клеток из стенок микроканала. Стратегии для усиления интеграции включают покрытие каналов ангиогенными факторами роста (VEGF, bFGF) или использование кокультур с перицитами и гладкомышечными клетками, которые стабилизируют зарождающиеся сосуды. Результатом является перфузионная, интегрированная с хозяином сосудистая сеть, которая может поддерживать большие объемы ткани, чем простая диффузия.

Поведение клеток в микроканалах

Эндотелиальное клеточное выравнивание и формирование люменов

Эндотелиальные клетки, культивируемые в гидрогелевых микроканалах, демонстрируют отчетливое морфологическое и функциональное поведение по сравнению с 2D-монослоями. Изогнутая геометрия канала заставляет клетки принимать более in-vivo-подобную форму, с продольными актиновыми напряженными волокнами, ориентированными вдоль оси канала. Это выравнивание имеет решающее значение для формирования непрерывного, сплоченного эндотелия, который может выдерживать физиологические сдвиговые напряжения. Образование люмена происходит посредством процесса, называемого коалесценцией вакуолей: внутриклеточная вакуольная форма и плавление, в конечном итоге создавая центральную полость, которая простирается вдоль канала. Наличие клеевых лигандов (например, RGD-пептидов) на стенках канала ускоряет этот процесс, способствуя опосредованной интегрином сигнализации. Каналы меньше 30 мкм благоприятствуют капиллярным структурам, в то время как более крупные каналы производят венулоподобные сосуды.

Системы кокультуры и перициты

В нативных тканях эндотелиальные клетки поддерживаются перицитами и клетками гладкой сосудистой мышцы, которые обеспечивают механическую стабилизацию и паракриновую сигнализацию. Было показано, что включение этих фресочных клеток в гидрогелевые микроканалы улучшает зрелость и долговечность сосудов. Модели кокультуры обычно семявыводящие эндотелиальные клетки внутри просвета и перицитов в окружающей гидрогелевой матрице. Перициты продлевают процессы в направлении канала, устанавливая контакты клеток и осаждая белки мембраны основания (коллаген IV, ламинин). Это взаимодействие предотвращает регрессию сосудов и снижает проницаемость, создавая барьерную функцию, аналогичную гематоэнцефалическому барьеру. Недавние работы также продемонстрировали, что системы трикультуры, добавляющие фибробласты или мезенхимальные стволовые клетки, могут производить более прочные, стабильные микрососуды, которые выживают в течение нескольких месяцев in vitro .

Влияние микроэкологических сигналов

Сама гидрогелевая матрица может быть спроектирована для представления биохимических и биофизических сигналов, влияющих на поведение клеток. Жесткость, пористость, скорость деградации и плотность лиганда влияют на прорастание эндотелия и стабильность просвета. Например, гидрогели с модулями хранения 400-800 Па (похожие на печень или жировую ткань) поддерживают оптимальный капиллярный морфогенез, в то время как более жесткие матрицы (1500 Па или выше) индуцируют инвагинацию или регрессию сосудов. Разлагаемые гидрогели позволяют клеткам ремоделировать матрицу, которая необходима для прорастания ангиогенеза. Кроме того, иммобилизованные факторы роста, такие как VEGF и Ang-1, могут быть привязаны к стенкам канала для создания градиентов, которые направляют направленный рост. Эти микроэкологические параметры должны быть тщательно сбалансированы для достижения долгосрочной функциональности сосуда.

Приложения и будущие направления

Сосудистые ткани

Для применения в диапазоне от кожных клапанов до сердечных пластов, предварительно сформированные микроканалы, выстланные аутологичными эндотелиальными клетками, могут ускорить интеграцию трансплантата и уменьшить некроз. Исследования на животных показали, что преваскуляризированные конструкции, содержащие микроканальные сети, демонстрируют значительно более высокие показатели выживаемости и более быструю инфильтрацию сосудов-хозяев по сравнению с неваскуляризированными элементами управления. В контексте инженерии костной ткани микроканальные гидрогели, нагруженные остеогенными клетками и эндотелиальными клетками, продемонстрировали усиленную регенерацию костей в дефектах критического размера. Следующим шагом является масштабирование этих конструкций до клинически значимых размеров (несколько кубических сантиметров) при сохранении перфузии по всему объему.

Системы Organ-on-a-Chip

Микрофлюидные устройства на чипе все чаще используют гидрогелевые микроканалы для моделирования микроциркуляции. Эти платформы интегрируют перфузионное канальное отделение с паренхимальными клетками (например, гепатоциты, кардиомиоциты, эпителиальные клетки легких), разделенные пористой гидрогелевой мембраной. Эндотелиальные клетки на одной стороне канала образуют барьер, имитирующий интерфейс ткани крови. Эта конфигурация используется для изучения переноса лекарств, воспаления и тромбоза. Микроканалы гидрогеля также позволяют включать компоненты ECM из конкретных органов, улучшая физиологическую релевантность. Несколько коммерческих систем на чипе теперь полагаются на микроканалы на основе гидрогеля в качестве ключевого компонента, что позволяет проводить высокопроизводительное тестирование лекарств и персонализированную медицину.

Регенеративная медицина

В регенеративной медицине исследуются гидрогелевые микроканалы для васкуляризации in situ, побуждающие организм выращивать новые кровеносные сосуды в каркас, предоставляя шаблон. Вводимые гидрогели, которые образуют микроканалы при воздействии температуры тела или pH, находятся в стадии исследования. Эти материалы могут быть введены в виде жидкости, а затем самособираются в канальную структуру, которая привлекает эндотелиальные клетки хозяина. Другой подход использует децеллюляризованные гидрогели ECM, которые сохраняют нативные биохимические сигналы; при засеянии эндотелиальными клетками и образовании в каналы, эти гидрогели показывают высокую степень васкуляризации в доклинических моделях. Конечной целью является производство готовых васкуляризованных тканевых конструкций, которые могут использоваться для замены поврежденных органов без необходимости сложного микрохирургического анастомоза.

Интеграция с микрофлюидами

Комбинирование гидрогелевых микроканалов с внешними микрофлюидными насосами обеспечивает динамическую перфузионную культуру, которая необходима для долгосрочного обслуживания и созревания сосудов. Системы, которые включают программируемые структуры потока, градиенты кислорода и химическую стимуляцию, могут имитировать сложную гемодинамику нативной сосудистой системы. Например, было показано, что циклическое растяжение, аналогичное артериальной пульсативности, применяется через микрофлюидную камеру для улучшения эндотелиального выравнивания и барьерной функции. Кроме того, интеграция электродов или датчиков в стенки каналов позволяет в режиме реального времени контролировать проницаемость сосудов, рН и концентрации метаболитов. Ожидается, что такие «умные» сосудистые чипы ускорят скрининг лекарств и моделирование заболеваний.

Проблемы и ограничения

Структурная целостность и долгосрочная стабильность

Одним из основных препятствий является поддержание проходимости микроканала в течение длительных периодов. Гидрогели по своей природе мягкие и могут разрушаться или разрушаться под непрерывным перфузионным давлением. Стратегии усиления каналов включают оптимизацию плотности сшивания, включение протеолитически устойчивых полимеров или добавление тонкого слоя покрытия ECM, такого как фибрин или гель коллагена вокруг просвета. Тем не менее, многие современные системы страдают от утечки или разрыва канала после одной-двух недель перфузии. Разработка гидрогелей, которые обеспечивают баланс между разлагаемостью (чтобы позволить ремоделирование) и механической прочностью является активной областью исследований.

Масштабирование и сосудистая иерархия

Естественная сосудистая система иерархическая: крупные артерии разветвляются на артериолы, а затем на капилляры. Для репликации этой иерархии в инженерной конструкции требуются каналы нескольких диаметров, которые плавно переходят из одной шкалы в другую. Многие технологии изготовления изо всех сил пытаются создать такие многомасштабные сети, не жертвуя разрешением или не вызывая высокой текучести. Такие методы, как жертвенное раскачивание и послойное укладывание, обещают, но создание полномасштабного иерархического дерева, которое простирается от миллиметров до нескольких микрометров, остается серьезной инженерной задачей.

Гетерогенные клеточные популяции

Функциональная сосудистая сеть не состоит исключительно из эндотелиальных клеток; она также включает перициты, клетки гладкой мышцы, фибробласты и иммунные клетки. Кокультивирование этих различных типов клеток в правильной пространственной организации в микроканалах нетривиально. Выбор культуральной среды, добавки фактора роста и плотности посева клеток должен быть оптимизирован для поддержки жизнеспособности каждого типа клеток, предотвращая чрезмерный рост. Кроме того, при использовании клеток человека должна учитываться иммунная совместимость самого гидрогелевого материала. Вариабельность в первичных клетках и синтез гидрогеля добавляет дополнительную сложность к переводу васкуляризации на основе микроканала в клиническое использование.

Заключение

Микроканалы на основе гидрогеля представляют собой мощную платформу для создания функциональной микроваскулатуры in vitro и in vivo. Достижения в области изготовления — от фотолитографии до 3D-биопечати — позволили с высокой точностью управлять геометрией каналов, что позволяет строить перфузионные сети, которые поддерживают выживание клеток и специфические для органов функции. Взаимодействие между конструкцией каналов, матричными свойствами и клеточным поведением продолжает выясняться, направляя развитие более зрелых и стабильных сосудов. Хотя проблемы остаются в масштабировании, долгосрочной стабильности и многоклеточной интеграции, поле быстро прогрессирует. По мере созревания этих технологий они, вероятно, позволят создавать васкуляризированные тканевые трансплантаты, передовые модели органов на чипе и, в конечном счете, биоинженерные целые органы.

Для дальнейшего чтения см.: Обзор материалов по гидрогелям для тканевой инженерии ; Передовые материалы по 3D-биопечати васкуляризованных тканей ; Биоматериалы по жертвенному раскачиванию для микрососудистых сетей ; и Расследование лаборатории на органе-на-чипе с гидрогелевыми микроканалами.