Способность создавать функциональные сосудистые сети остается одной из самых сложных, но важных целей в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Без встроенного кровоснабжения толстые инженерные ткани не могут выжить после имплантации из-за недостатка кислорода и питательных веществ. Микрофабрикованные каналы - точно спроектированные микромасштабные пути - предлагают мощную стратегию, чтобы направлять формирование искусственной сосудистой системы, имитируя физические сигналы, которые используют естественные кровеносные сосуды во время разработки. Контролируя геометрию каналов, химию поверхности и механические свойства, исследователи могут направлять миграцию эндотелиальных клеток, выравнивание и образование просвета, тем самым создавая перфузионные сети, которые интегрируются с циркуляцией хозяина. В этой статье рассматриваются ключевые методы изготовления микроканалов, биологические механизмы, которые они используют, их текущие приложения и оставшиеся препятствия для клинического перевода.

Микрофабрикованные каналы: точные инструменты для сосудистой инженерии

Естественные кровеносные сосуды образуются через комбинацию ангиогенеза (прорастая из существующих сосудов) и васкулогенеза (сборка новых эндотелиальных клеток). Эти процессы полагаются на сложное взаимодействие химических градиентов, взаимодействий внеклеточного матрикса (ECM) и физических сил. Микрофабрикованные каналы воспроизводимы многие из этих сигналов контролируемым, воспроизводимым образом. Как правило, созданные из таких материалов, как полидиметилсилоксан (PDMS), гидрогели (например, коллаген, фибрин, желатиновый метакрилоил) или биоразлагаемые полимеры, эти каналы могут быть разработаны с диаметрами от десятков до сотен микрометров - соответствие масштабам капилляров, артериол и венул. Способность структурировать каналы в двумерных (2D) планарных макетах или трехмерных (3D) сетях позволяет исследователям строить сосудистые архитектуры, которые близко напоминают нативную ткань, обеспечивая физические каркасы , которые направляют клеточную самоорганизацию

Техника изготовления и материальные соображения

Несколько передовых методов микрофабрикации были адаптированы из полупроводниковых и микроэлектромеханических систем (MEMS) для создания сосудистых каналов. Выбор техники зависит от требуемого разрешения, материала, трехмерности и совместимости с клеточной культурой.

Мягкая литография

Мягкая литография остается наиболее широко используемым методом изготовления микрофлюидных каналов в тканевой инженерии. Она включает в себя создание основной формы с использованием фотолитографии на кремниевой пластине, затем литье эластомера - обычно PDMS - над плесенью для получения узорчатой плиты после отверждения. PDMS является прозрачной, газопроницаемой и биосовместимой, что делает ее идеальной для наблюдения за поведением клеток. Каналы, узкие как 1 мкм, могут быть воспроизведены с высокой точностью. Исследователи могут связывать каналы PDMS со стеклом или другими субстратами для формирования закрытых каналов. Основное ограничение заключается в том, что PDMS не разлагается, поэтому он в основном используется для моделей in vitro или в качестве жертвенного шаблона для гидрогелей.

Для создания биоразлагаемых каркасов мягкую литографию можно применять к природным или синтетическим гидрогелям путем репликного формования жертвенных материалов (например, желатина, альгината или плуронового F-127). После того, как гидрогель сшивается, жертвенный шаблон растворяется или термически удаляется, оставляя после себя полую канальную сеть. Этот подход использовался для получения перфузионных каналов в коллагеновых и фибриновых гелях.

фотолитография

Фотолитография использует свет для передачи геометрического рисунка от фотомаски к фоточувствительному материалу (фоторезист) на подложке. Традиционная фотолитография производит 2D-образцы, но укладка нескольких слоев или использование наклонного воздействия может создавать рудиментарные 3D-структуры. Последние достижения в двухфотонной полимеризации позволяют напрямую записывать 3D-микроканалы с разрешением субмикрометра внутри фоточувствительной смолы. Этот метод может генерировать сложные ветвящиеся геометрии, включая бифуркации и изогнутые сосуды, которые близко имитируют естественные сосудистые деревья. Основными недостатками являются высокая стоимость, медленная скорость (последовательность записи) и ограниченные варианты материала (в основном акриловые фоторезисты, которые могут быть не оптимальными для клеточной культуры).

3D биопечать

Экструзионная и струйная биопечать появились в качестве гибких методов для изготовления сосудистых каналов внутри клеточных гидрогелей. Путем печати жертвенных чернил (например, желатинового, плуронового или углеводного стекла) в желаемом рисунке, а затем инкапсулируя его объемным гидрогелем и впоследствии удаляя жертвенный материал, исследователи могут создавать перфузионные сети. Этот подход позволяет специфичную для пациента геометрию и интеграцию нескольких типов клеток. Например, группа Ли в Университете Райса использовала 3D-печатную решетку из углеводного стекла для создания сосудистой сети в фибриновой матрице, которая поддерживала эндотелиальную клеточную облицовку и поток красных кровяных клеток. Ограничения включают разрешение (обычно 200-500 мкм) и необходимость обеспечить полное удаление жертвенного материала без повреждения окружающих клеток.

Лазерная абляция

Фемтосекундная лазерная абляция может вырезать микроканалы внутри гидрогелей или даже живых тканей с высокой точностью. Лазерные импульсы испаряют материал локально, создавая каналы размером до нескольких микрометров в диаметре. Этот метод не требует формы или жертвенного шаблона и может производить произвольные 3D-траектории. Особенно полезен для изготовления каналов в плотных коллагеновых матрицах или на децеллюлярных тканевых каркасах. Однако процесс может генерировать тепло и мусор, которые могут нанести вред близлежащим клеткам, и это отнимает много времени. Несмотря на эти проблемы, лазерная абляция использовалась для создания сетей капиллярного размера in vitro и для подключения микроканалов к более крупным питательным сосудам.

Руководство клеточным поведением с помощью микроканального дизайна

Успех микроканальной васкуляризации зависит от того, насколько хорошо физические и химические особенности каналов воспроизводят нативную микросреду. Эндотелиальные клетки (ЭК) ощущают топографию, жесткость и сдвигающий стресс, и они реагируют на реорганизацию своего цитоскелета, поляризацию и формирование просветовых структур.

Физические сигналы: топография, геометрия и жесткость

Ширина канала, высота и кривизна диктуют выравнивание ECs. Прямые каналы способствуют одноосному выравниванию, в то время как бифуркации стимулируют прорастание. Каналы с диаметрами ниже 50 мкм заставляют ECs образовывать монослой, выстилающий внутреннюю стенку, производя патентный просвет. Так называемый эффект «контактного наведения» опосредован спайками на основе интегрина к поверхности канала. Если поверхность узорчата с гребнями или канавками (например, с помощью наноимпринтинга), ECs выравнивается еще сильнее. Жесткость матрицы также имеет значение: на мягких подложках (0,5-5 кПа, типичный для мозга и жира), ECs образуют более стабильные сети; на жестких подложках (>50 кПа, как кость), они имеют тенденцию к распространению и образованию монослоев.

Сдвиг напряжения от потока жидкости является еще одним критическим физическим сигналом. При перфузии при физиологических скоростях потока (0,5-10 дина см-2), ECs активируют гены, связанные с гомеостазом сосудов, такие как KLF2 и eNOS , и они выравниваются в направлении потока. Микроканалы позволяют точно контролировать скорость потока и давление, позволяя исследователям изучать ангиогенез и барьерную функцию, зависящую от сдвига.

Биохимические компоненты: градиенты фактора роста

Естественный ангиогенез обусловлен градиентами эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и ангиопоэтинов. Микроканалы могут быть модифицированы для представления этих факторов пространственно контролируемым образом - например, путем встраивания микрочастиц, загруженных фактором роста, в стенки канала или с помощью генератора микрофлюидного градиента. Покрытие поверхностей канала адгезивными белками, такими как фибронектин или коллаген IV, способствует прикреплению EC и предотвращает аноикис. Некоторые группы разработали каналы, которые высвобождают VEGF в ответ на активность матриксной металлопротеиназы (MMP), имитируя динамическую среду прорастающих сосудов.

Взаимодействия матрицы ячейки

Композиция ECM внутри и вокруг канала играет двойную роль: она обеспечивает структурную поддержку и представляет биохимические сигналы. Каналы, изготовленные в гидрогелях, богатых коллагеном I и фибрином, поддерживают устойчивую пролиферацию и прорастание EC, потому что эти матрицы содержат интеграно-связывающие сайты (например, RGD-последовательности) и легко реконструируются MMP-производными клетками. Напротив, синтетические гидрогели (например, на основе PEG) должны быть функционализированы с помощью адгезивных пептидов и MMP-расщепляемых перекрестных линкеров, чтобы обеспечить инвазию клеток и формирование сети. Микроканалы также позволяют совместно культивировать с клетками мурала (перициты, клетки гладких мышц сосудов) пространственно определенным образом - встраивание перицитов в объемный гидрогель вблизи канала способствует стабилизации сосудов и созреванию просвета.

Формирование функциональных сосудистых сетей

После того, как клетки засеяны и каналы перфузированы, ряд клеточных событий приводит к образованию связанной функциональной сосудистой сети.

Эндотелиальное клеточное выравнивание и люменогенез

В течение нескольких часов после посева, ECs прилипают к стенкам микроканала и начинают удлиняться. В течение следующих 1-3 дней они образуют сливной монослой, выстилающий весь канал. В каналах, более широких, чем ~50 мкм, ECs могут сначала покрывать пол и потолок, в конечном итоге мостик для создания цилиндрического просвета. Образование непрерывного, плотного соединения-запечатанного монослоя имеет важное значение для барьерной функции. Исследования с использованием платформы «сосуд-на-чипе» лаборатории Ингбера продемонстрировали, что ECs в микроканалах развивают функциональные стыки прилипников (VE-кадгерин) и плотные соединения (claudin-5), и они демонстрируют избирательную проницаемость для растворителей разных размеров.

Набор перицитов и созревание сосудов

Для долгосрочной стабильности капилляры должны быть обернуты перицитами или клетками гладкой мышцы. Микроканалы, изготовленные в гидрогелях, могут включать эти фресочные клетки в окружающую матрицу. Когда среда содержит тромбоцит-производный фактор роста-BB (PDGF-BB), перициты мигрируют в сторону канала, выровненного EC, и продлевают процессы, которые контактируют с эндотелиальной трубкой. Это взаимодействие вызывает осаждение белков мембраны фундамента (ламинин, коллаген IV) и уменьшает пролиферацию EC - признаки созревания сосудов. Некоторые группы использовали двухфотонную лазерную абляцию для создания каналов различного размера, а затем совместно культивируемых перицитов, наблюдая, что небольшие каналы (30 мкм) набирают больше перицитов, чем большие, вероятно, из-за более высоких местных концентраций PDGF из EC.

Перфузия и анастомоз

В конечном счете, инженерная сосудистая сеть должна подключаться к циркуляции хозяина (если имплантирована) или к дополнительным флюидным портам (для моделей in vitro. Микроканалы часто проектируются с впускными и выпускными портами для непрерывной перфузии. В приложениях in vivo, инженерный канал может быть хирургически анастомосован к артерии и вене. Например, в модели крысы микроканальный гидрогель-имплантат был успешно подключен к бедренным сосудам и оставался перфузированным в течение нескольких недель. In vitro, соединяющий несколько микроканалов с большим резервуаром, позволяет исследователям тестировать транспорт лекарств и сдвиг-зависимые ответы высокопроизводительным способом.

Приложения в тканевой инженерии и моделировании заболеваний

Системы микросборных каналов — это не просто инструменты для исследований, они имеют практическое применение, которое охватывает разработку лекарств, биологию заболеваний и регенеративную терапию.

Орган-на-чипе платформы

Наиболее зрелым применением является формат «сосуд-на-чипе» или «орган-на-чипе», где микроканалы, выстланные с помощью EC, интегрированы с другими органоспецифичными клетками (например, гепатоцитами, кардиомиоцитами, эпителиальными клетками легких). Эти платформы воспроизводят микроархитектуру и функцию органов человека, позволяя проводить реалистичное тестирование на наркотики и скрининг токсичности. Примечательным примером является lung-on-a-chip, разработанный Институтом Висса , который содержит два параллельных микроканала, разделенных пористой мембраной — один из которых выстлан эпителиальными клетками легких, а другой с капиллярными ECs легких. Применяя циклическое растяжение, эта модель имитирует дыхательную механику и использовалась для изучения отека легких и ответов на лекарства.

Скрининг лекарств и токсикология

Микроканалы обеспечивают контролируемую среду для изучения сосудисто-ориентированной терапии. Исследователи могут перфузировать лекарства через канал и измерять целостность эндотелиального барьера, ингибирование ангиогенеза (например, анти-VEGF лекарствами) или образование тромбов. Небольшой объем микрофлюидных систем снижает потребление реагентов и позволяет получать высококонтентную визуализацию. Анализы проницаемости сосудов (с использованием флуоресцентного декстрана) и ангиогенного прорастания (от центрального канала в гидрогель-наполненный боковой канал) в настоящее время стандартны во многих лабораториях.

Сосудистые ткани

Для регенеративной медицины конечной целью является создание толстой имплантируемой ткани, которая предварительно васкуляризуется с использованием микроканалов. Сети предварительного сосуда могут быть выровнены с кишечными клетками пациента, а затем хирургически подключены к сосудистой системе хозяина, что сокращает время, необходимое для вспышки сосудов хозяина (что часто не удается из-за гипоксии). Недавние работы показали, что микроканальные гидрогели, засеянные EC и клетками гладких мышц, могут образовывать функциональные сосуды, которые остаются патентованными в течение нескольких недель после имплантации у мышей. Такие конструкции обещают восстановление ишемических тканей, реконструкцию крупных костных дефектов или создание васкуляризованных кожных трансплантатов для ожогов.

Проблемы и будущие направления

Несмотря на значительный прогресс, остается несколько препятствий, прежде чем микроканальная васкуляризация станет обычным клиническим инструментом.

Масштабируемость: Большинство современных методов изготовления производят небольшие (мм-размерные) образцы с ограниченным количеством каналов. Создание сосудистой сети, которая соответствует плотности и сложности человеческого органа (например, печени или почек) потребует высокой пропускной способности, автоматизированных методов. 3D-биопечать расширяется, но разрешение и скорость по-прежнему являются компромиссами.

Долгосрочная стабильность: EC-линии каналов в гидрогелях часто ухудшаются в течение нескольких недель из-за клеточно-опосредованного ECM ремоделирования. Балансировка матрицы перекрестного сшивания, чтобы позволить ремоделирование, предотвращая коллапс, затруднена. Ко-культура с перицитами улучшает стабильность, но достижение долгосрочной (> 1 месяц) проходимости, сопоставимой с нативными сосудами, остается проблемой.

Интеграция с сосудистой системой хозяина: При анастомозе имплантатов часто наблюдается несоответствие механических свойств (жесткость) и биохимических сигналов, приводящее к тромбозу или интимальной гиперплазии. Поверхностная инженерия (например, покрытие гепарином или противовоспалительными пептидами) может снижать образование сгустков. Необходимы лучшие стратегии индуцирования надежного анастомоза in situ.

Гетеротипические клеточные взаимодействия: Реальные сосудистые сети окружены множеством типов клеток (фибробласты, макрофаги, нервные клетки), которые модулируют поведение сосудов. Включение этих клеток пространственно контролируемым образом в микроканальные каркасы будет иметь важное значение для in vivo релевантности.

Стандартизация и воспроизводимость: Различные лаборатории используют различные протоколы изготовления и материалы, что затрудняет сравнение результатов. Разработка стандартных рабочих процедур, проверенных клеточных линий и коммерчески доступных микроканальных каркасов ускорит перевод.

Заключение

Микрофабрикованные каналы обеспечивают универсальную и мощную платформу для направления формирования сосудистой сети. Объединив точный геометрический контроль с биохимической функциональностью, исследователи могут воссоздать ключевые аспекты естественного ангиогенеза и производить функциональные, перфузируемые сосуды как in vitro , так и in vivo . Поле перешло от доказательств концепции до сложных моделей на чипе и ранних терапевтических имплантатов. Продолжение достижений в области масштабируемости изготовления, дизайна материала и клеточной сложности, вероятно, приблизит микроканальную васкуляризацию к клинической реальности - обеспечивая лучшие тканевые трансплантаты, более прогностическое тестирование лекарств и более глубокое понимание сосудистой биологии.