Использование микрососудистых фрагментов для улучшения формирования сосудистой сети

Использование микрососудистых фрагментов для улучшения формирования сосудистой сети

Сосудистость остается одним из наиболее значительных узких мест в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Без функционального кровоснабжения инженерные ткани не могут выжить за пределами диффузионного предела кислорода и питательных веществ, что приводит к центральному некрозу и недостаточности трансплантата. Среди стратегий, разработанных для преодоления этого ограничения, использование микрососудистых фрагментов (МВФ) появилось как особенно эффективный и биологически аутентичный подход. МВФ — это небольшие, неповрежденные сегменты микрососудов, которые сохраняют свой родной клеточный состав и архитектуру внеклеточного матрикса. При имплантации в каркас или участок дефекта эти фрагменты быстро прорастают, анастомозируют с циркуляцией хозяина и образуют стабильную, иерархически организованную сосудистую сеть. В этой статье представлен авторитетный обзор МВФ, их подготовка, механизмы действия, приложения в регенеративной медицине, текущие проблемы и будущее направление этой технологии.

Что такое микрососудистые фрагменты?

Микрососудистые фрагменты определяются как дискретные, цилиндрические сегменты кровеносных сосудов диаметром обычно от 15 до 50 микрометров и длиной от 50 до 300 микрометров. Они изолированы от донорских тканей — часто жировой ткани или кожи — посредством комбинации механического минирования и ферментативного пищеварения с последующей последовательной фильтрацией. В отличие от одноклеточных суспензий эндотелиальных клеток или перицитов, MVF сохраняют нативные взаимодействия перицитов-эндотелиальных клеток и компонентов мембраны основания, которые имеют решающее значение для быстрого формирования функциональных, стабильных сосудов. Ключевые клеточные компоненты MVF включают эндотелиальные клетки, выстилающие просвет, перициты, встроенные в мембрану фундамента, и случайные клетки гладкой мускулатуры в более крупных фрагментах. Эта многоклеточная композиция позволяет MVFs более точно повторять ранние стадии ангиогенеза и васкулогенеза, чем изолированные клеточные суспензии.

Изоляция и очистка MVF

Наиболее распространенным источником МВФ является жировая ткань человека, полученная путем липосакции или хирургического иссечения. Протокол изоляции следует стандартизированному рабочему процессу:

• Урожай: Жидкая ткань собирается в стерильных условиях и промывается буферным солевым раствором для удаления крови и липидов.
• Механическое нарушение: Ткань тонко фаршируется с использованием скальпелей или гомогенизатора ткани для получения шлама.
• Энзиматическое пищеварение:] Суспензию инкубируют коллагеназой или нейтральной протеазой при мягком возбуждении в течение 20–40 минут при 37°С для высвобождения MVF из внеклеточного матрикса.
• Фильтрация: Дайджест пропускают через серию фильтров (обычно 500 мкм, затем 100 мкм, затем 40 мкм) для отделения МВФ от стромальных клеток, адипоцитов и более крупных обломков.
• Промывка и концентрация: Сохранённая фракция (обычно на фильтре 40 мкм) собирается и промывается центрифугированием. Получившаяся гранула богата MVF.

Также были исследованы альтернативные источники, такие как скелетные мышцы или оментум, хотя жировая ткань остается предпочтительным источником из-за ее обилия, легкости сбора и высокой плотности микрососудов. Выход и жизнеспособность MVF критически зависят от донорского участка, концентрации фермента пищеварения и продолжительности пищеварения. Оптимизированные протоколы теперь обычно достигают выходов 10 ⁴ ] до 10 ⁵ MVF на грамм жировой ткани, с жизнеспособностью, превышающей 90%.

Характеристика MVF

Для воспроизводимости необходим контроль качества препаратов MVF. Стандартная характеристика включает:

• Морфометрический анализ: Световая микроскопия для подсчета фрагментов, измерения длины и диаметра и оценки структурной целостности.
• Окрашивание жизнеспособности: Живые/мертвые анализы с использованием кальциин-АМ и пропидиевого йодида для подтверждения выживаемости эндотелия и перицитов.
• Иммунофлуоресценция: Окрашивание эндотелиальных маркеров (CD31, vWF) и маркеров перицитов (α-SMA, NG2) для подтверждения клеточного состава и расположения.
• Функциональное тестирование: Анализы фибрина in vitro или матригеля для количественной оценки прорастания — количество и длина капиллярных выростов через 24-72 часа.

Высококачественные MVF демонстрируют неповрежденные люмены, непрерывный слой CD31-положительных эндотелиальных клеток, окружающие α-SMA-положительные перициты, и способность прорастать в течение 24 часов при встраивании в разрешительную матрицу.

Механизмы формирования сосудистой сети

MVF способствуют васкуляризации через два комплементарных механизма: прорастание ангиогенеза и иноскуляции. Прорастание ангиогенеза предполагает активацию эндотелиальных клеток внутри фрагмента, которые деградируют окружающую подвальную мембрану, мигрируют в каркас и образуют новые капиллярные почки. Этот процесс обусловлен градиентами VEGF, FGF-2 и других ангиогенных факторов, присутствующих в раневой среде или экзогенно поставляемых. MVF выделяют многие из этих факторов сами, создавая аутокринную петлю, ускоряющую неоваскуляризацию.

Иноскуляции относится к прямой связи (анастомоз) между прорастающими сосудами из MVFs и существующей микроваскулатуры хозяина. Поскольку MVF уже обладают неповрежденной стенкой сосуда с внутренней эндотелиальной облицовкой, они могут быстро сливаться с капиллярами хозяина, устанавливая функциональный кровоток в течение 3-7 дней после имплантации. Это значительно быстрее, чем 10-14 дней, обычно требуется при использовании одиночных эндотелиальных клеток, которые должны сначала собраться в примитивные трубки, прежде чем формировать анастомозы.

Роль перицитов в стабилизации

Отличительной особенностью МВФ является наличие перицитов. Эти сократительные клетки оборачиваются вокруг эндотелиальных трубок и выделяют ангиопоэтин-1 и другие сигналы созревания, способствующие стабилизации сосудов и уменьшению утечки. В сетях, полученных из МВФ, покрытие перицитами начинается в течение нескольких дней после имплантации, что приводит к меньшему кровоизлиянию и большей долговечности сосудов по сравнению с сосудами, образованными из чистых эндотелиальных клеточных суспензий. После имплантации поддерживается тесный физический контакт перицитов и эндотелия внутри фрагмента, обеспечивающий архитектурный шаблон для новых сосудов.

Преимущества перед другими стратегиями васкулирования

Было изучено несколько подходов к васкуляризации тканеинженерных конструкций, включая доставку ангиогенных факторов роста, предваскуляризацию с использованием эндотелиальных клеток или эндотелиальных клеток-предшественников, а также проектирование каркасов, включающих микроканалы. MVFs предлагают явные преимущества:

• Скорость: Функциональный анастомоз в течение 3-7 дней по сравнению с >10 днями для клеточной предваскуляризации.
• Стабильность: Покрытие перицитами приводит к зрелым, менее протекающим сосудам, которые сохраняются в течение длительного времени.
• Одноступенчатая доставка: MVF могут быть непосредственно включены в каркасы без необходимости предварительной обработки или дополнительных этапов посева клеток.
• Автогенная доступность: Получена из собственного жира пациента, устраняя иммуногенность и этические проблемы.
• Масштабируемость: Один грамм жировой ткани дает тысячи МВФ, достаточных для клинически значимых размеров конструкции.

В то время как доставка фактора роста может стимулировать вспышку сосудов-хозяев, она часто приводит к незрелым, протекающим сосудам и несет риски аберрантного ангиогенеза. Суспензии эндотелиальных клеток требуют недель предварительной культуры для формирования сетей и часто не имеют периваскулярных клеток. Микроканальные каркасы (например, напечатанные на 3D-принтере сосудистые шаблоны) зависят от долгосрочного ремоделирования и могут не достигать быстрой перфузии. МВФ сочетают биологическое богатство нативных микрососудов с эксплуатационной простотой фрагмента ткани, что делает их одним из наиболее перспективных строительных блоков для быстрой и надежной васкуляризации.

Применение в регенеративной медицине

Регенерация кожи и исцеление ран

Хронические раны и крупные дефекты кожи требуют трансплантатов, которые могут быстро реваскуляризироваться для предотвращения некроза. Когда MVF встраиваются в кожные каркасы или гидрогели и наносятся на полноте раны кожи на животных моделях, они значительно ускоряют закрытие ран и улучшают качество регенерированной ткани. В крысиной модели каркасы, содержащие MVF, показали ~70% кровотока в течение 3 дней по сравнению с ~20% в органах управления и продемонстрировали более толстую грануляционную ткань и снижение рубцевания в 14 дней. Высокая плотность начального образования сосудов уменьшает ишемию и обеспечивает разрешительную среду для миграции кератиноцитов и эпидермальной регенерации.

Ремонт костей и остеоинтеграция

Костные трансплантаты требуют быстрой реваскуляризации для поддержки выживания остеобластов и нового осаждения костей. Когда MVF сочетаются с остеопроводящими каркасами, такими как гидроксиапатит / β-трикальциевый фосфат (HA / β-TCP), полученная конструкция показывает усиленный ангиогенез и образование костей. В кальвариальных дефектах критического размера у мышей, нагруженные MVF каркасы демонстрируют в два раза более высокую плотность сосуда и в три раза больше новой кости, чем только каркасы, с недавно сформированной костью, демонстрирующей зрелую гаверсову архитектуру на 8 недель. Сосудистая сеть, образованная MVF, обеспечивает обмен кислорода и питательных веществ, необходимых для метаболически активных остеобластов, а также доставляет циркулирующие клетки-предшественники остеобластов в участок.

Скелетно-мышечная ткань Инженерия

Восстановление васкуляризированных скелетных мышц является основной целью для лечения объемной потери мышц. МВФ были встроены в фибриновые гидрогели или децеллюляризованные мышечные матрицы и имплантированы в мышечные дефекты. Быстрое образование перфузированных капилляров поддерживает выживание совместно доставляемых мышечных предшественников, что приводит к регенерации миофибра и улучшению функционального восстановления. Электрофизиологические исследования показывают, что MVF-инженерные мышцы строят контракт с силами, приближающимися к 50-70% нативной мышцы в течение четырех недель, заметное улучшение по сравнению с не васкуляризированными контрольными.

Сердечные и сосудистые трансплантаты

Для сердечных пластов и сосудистых трансплантатов малого диаметра немедленная перфузия имеет решающее значение для предотвращения тромбоза и обеспечения проходимости. МВФ, сеянные в пористые полиуретановые или коллагеновые каркасы, производят флюентную эндотелиальную подкладку на поверхности люминала в течение 24-48 часов и рекрутируют окружающие перисосудистые клетки для стабилизации трансплантата. При использовании в качестве коронарного шунта в модели свиньи, конструкции с семенами MVF показали 90% проходимости в 6 месяцев, с доказательствами полной эндотелиализации и отсутствия образования аневризмы. Аутологичная природа МВФ также снижает потребность в системной антикоагуляции.

Трансплантация островков поджелудочной железы

Одной из основных проблем при трансплантации островков является недостаточная реваскуляризация островков после инфузии в портальную вену. Встраивание островков вместе с МВФ в биосовместимый гидрогель до трансплантации улучшает доставку кислорода и сокращает время до функциональной приживления. В моделях диабетической мыши сотрансплантация МВФ и островков приводила к нормогликемии в течение одного дня (против пяти дней с одними островками) и улучшала гликемический контроль в течение 12 недель. МВФ создали разрешительную микросреду, которая сохранила островковую архитектуру и секрецию инсулина.

Интеграция с биоматериалами и строительными лесами

Способ доставки MVF существенно влияет на их производительность. MVF обычно суспендируют в естественном или синтетическом гидрогеле (например, фибрине, коллагене, альгинате, гиалуроновой кислоте, гидрогелях на основе ПЭГ) и затем вводят или формуют с помощью каркаса. Ключевые соображения дизайна включают:

• Размер пор и межсоединенность: Полы должны иметь поры > 100 мкм, чтобы обеспечить проникновение и прорастание MVF с высокой взаимосвязанностью для вспенения судна-хозяина.
• Скорость деградации: Эшафот должен деградировать со скоростью, соответствующей образованию новой ткани. Фибрин обеспечивает начальную структурную поддержку при быстрой реконструкции; более медленно разрушающиеся полимеры, такие как PLGA, могут поддерживать механическую поддержку во время процесса васкуляризации.
• Освобождение фактора роста: Контролируемое высвобождение VEGF, FGF-2 или PDGF может быть встроено в матрицу для дальнейшего стимулирования прорастания MVF и набора судна-хозяина.
• Механические свойства: Матричная жесткость должна имитировать жесткость ткани-мишени — более мягкие матрицы (0,1-1 кПа) способствуют ангиогенезу, в то время как более жесткие матрицы (2-10 кПа) необходимы для костных или хрящевых каркасов.