Использование ферментно-связанного анализа иммуносорбента (элиза) при обнаружении загрязняющих веществ в воде

Использование анализа иммуносорбента, связанного с ферментом (ELISA), при обнаружении загрязняющих веществ в воде

Загрязнение воды остается одной из самых насущных глобальных проблем общественного здравоохранения. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, по меньшей мере 2 миллиарда человек ежегодно используют источник питьевой воды, загрязненный фекалиями, что приводит к миллионам смертей от диарейных заболеваний, холеры и других болезней, передающихся через воду. Помимо микробных угроз химические загрязнители, такие как пестициды, тяжелые металлы и промышленные побочные продукты, незаметно накапливаются в водоснабжении, вызывая долгосрочные канцерогенные и неврологические эффекты. Для устранения этих рисков регулирующим органам и водохозяйственным предприятиям необходимы методы мониторинга, которые являются не только чувствительными и специфическими, но и быстрыми и экономически эффективными для рутинного скрининга. Связанный с ферментами иммуносорбентный анализ (ELISA) стал мощным инструментом на этой арене, преодолев разрыв между лабораторным аналитическим прибором и полевыми тестовыми наборами.

«ELISA предлагает уникальное сочетание высокой пропускной способности, количественной точности и операционной простоты, что делает его идеальным как для централизованных лабораторий по тестированию воды, так и для децентрализованных приложений для точек использования». — Журнал экологических наук и здравоохранения, часть B

Что такое ELISA? Принципы и варианты

Анализ ферментно-связанного иммуносорбента представляет собой биохимический метод, который использует изысканную специфичность связывания антитела-антигена для обнаружения и количественной оценки целевого аналита. В своей простейшей форме ELISA использует антитело, иммобилизованное на твердой поверхности (обычно пластину микротитра полистирола или магнитную бусину), для захвата целевого загрязнителя из образца воды. Затем антитело обнаружения, конъюгированное с ферментом, связывается с захваченным аналитом. Наконец, добавляется хромогенный, фторогенный или хемилюминесцентный субстрат; фермент катализирует реакцию, которая генерирует измеримый сигнал, обычно изменение цвета, пропорционально количеству присутствующей мишени.

За десятилетия доработки было разработано несколько конфигураций ELISA, каждая из которых подходит для различных типов загрязняющих веществ:

Для тестирования качества воды наиболее распространены сэндвичи и конкурентные форматы ELISA. Микробиологические загрязнители (патогены, индикаторные бактерии) обычно обнаруживаются с помощью сэндвич-анализов, в то время как химические загрязнители (пестициды, микотоксины) используют конкурентные форматы.

Как ELISA обнаруживает загрязнители воды: подробный рабочий процесс

Подготовка образцов и предварительная концентрация

Образцы воды часто требуют предварительной концентрации перед ELISA, поскольку концентрации загрязняющих веществ могут опускаться ниже предела обнаружения метода. Фильтрация через мембраны 0,22 мкм захватывает бактериальные клетки; картриджи для экстракции твердой фазы (SPE) или концентрированные органические загрязнители для экстракции жидкой жидкости. Для вирусных загрязнителей используется осадок полиэтиленгликолем или ультрафильтрацией. Правильный препарат образца минимизирует матричную интерференцию из гуминовых кислот, солей и твердых частиц.

Осуждение казни

  1. Иммобилизация: Улавливающее антитело пассивно адсорбируется на скважины 96-луночного микротитра или ковалентно прикрепляется к магнитным шарикам. Пластина промывается для удаления несвязанного антитела.
  2. Блокировка: Добавляют белковый раствор (например, альбумин сыворотки крупного рогатого скота, казеин) для того, чтобы занять любые оставшиеся места связывания на поверхности пластика, предотвращая неспецифическую адсорбцию компонентов образца.
  3. Пробная инкубация: Обработанные образцы воды или стандарты добавляются в заблокированные скважины. Аналиты-мишени связываются с антителами захвата. После инкубации несвязанный матрикс удаляется промывкой.
  4. Обнаружение Антитела: Добавляется фермент-конъюгированное вторичное антитело (для сэндвич-анализов) или меченое конкурентное (для конкурентных анализов).
  5. Энзимная реакция: Добавляют субстратный раствор (например, TMB для хреновой пероксидазы). Фермент превращает субстрат в цветной продукт. Реакция прекращается через фиксированное время с использованием кислотного стоп-раствора.
  6. Вывод: Поглощение измеряется на соответствующей длине волны с помощью спектрофотометра (считыватель микропланет). Оптическая плотность пропорциональна концентрации аналита в образце.

Количественная оценка и валидация

Стандартная кривая, полученная из известных концентраций целевого загрязнителя, позволяет интерполировать концентрации образца. Большинство коммерческих наборов ELISA включают в себя элементы управления и стандарты калибровки. Шаги контроля качества, такие как подскоки известных количеств загрязняющего вещества в чистую воду (матричные шипы) и анализ дублирующих образцов, необходимы для обеспечения точности. Результаты обычно сообщаются в микрограммах на литр (мкг / л) для химических веществ или колониеобразующих единиц на 100 мл (CFU / 100 мл) для бактерий.

Преимущества использования ELISA при тестировании воды

Чувствительность и специфичность

Современные наборы ELISA могут обнаруживать загрязняющие вещества на уровнях частей на миллиард (ppb) или даже частей на триллион (ppt), удовлетворяя строгим максимальным уровням загрязняющих веществ (MCL), установленным такими агентствами, как Агентство по охране окружающей среды США (EPA). Специфика, присуждаемая моноклональными или высокоочищенными поликлональными антителами, гарантирует, что анализ отличает целевой анализируемый аналит от структурно подобных соединений, критически важных при тестировании на отдельные пестициды в сложных экологических матрицах.

Скорость и пропускная способность

Полное ELISA может быть выполнено за 1-4 часа, в зависимости от времени инкубации и количества шагов промывки. С 96-луночными пластинами сотни образцов могут быть обработаны параллельно, что делает ELISA идеальным для крупномасштабных программ наблюдения и реагирования на вспышки. Преимущество времени по сравнению с традиционными методами культуры (которые занимают 24-48 часов для бактерий) или инструментальный анализ (часы на образец, включая подготовку образца) является значительным.

Экономическая эффективность и простота

По сравнению с газовой хроматографией-масс-спектрометрией (GC-MS) или индуктивно связанной плазменной масс-спектрометрией (ICP-MS), ELISA не требует дорогостоящих приборов, специализированных лабораторных помещений или высококвалифицированного персонала для работы. Коммерческие комплекты ELISA стоят от 5 до 20 долларов США за тест, что делает рутинный мониторинг экономически жизнеспособным даже для ограниченных ресурсов. Многие комплекты предназначены для использования с портативными считывателями с батарейным питанием, что позволяет проводить испытания на месте в полевых условиях.

Портативность и простота использования

Последние разработки миниатюризировали ELISA в устройства бокового потока (полосные тесты) и микрофлюидные чипы. Эти форматы требуют не более капли воды и нескольких минут для получения визуального или цифрового результата. Такие варианты ELISA с возможностью развертывания на местах неоценимы для аварийных служб, оценивающих загрязнение воды в скважинах после наводнений или химических разливов.

Многоуровневые возможности

Несколько загрязняющих веществ могут быть обнаружены одновременно путем иммобилизации различных антител захвата в различных скважинах одной и той же пластины или с использованием систем проточной цитометрии на основе бусин (мультиплекс ELISA). Это позволяет проводить скрининг одного образца воды для группы патогенов, токсинов или пестицидов за один раз, что значительно повышает эффективность тестирования.

Применение в обнаружении загрязняющих вод

Бактериальные патогены и индикативные организмы

ELISA широко используется для мониторинга Escherichia coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae и Campylobacter jejuni Коммерческие комплекты ELISA для E. coli O157:H7 могут обнаруживать всего 10-100 CFU/мл после короткого этапа обогащения. Для бактерий с фекальными индикаторами ELISA предлагает более быструю альтернативу традиционной мембранной фильтрации и селективной пошивке, особенно при скрининге большого количества образцов во время исследований вспышки.

Водные вирусы и простейшие

Вирусные патогены, такие как норовирус, вирус гепатита А и аденовирус, все чаще признаются причинами болезней, передаваемых через воду. Для обнаружения норовирусов в поверхностных водах и водах, растущих на моллюсках, была разработана обратная транскрипция-ELISA (RT-ELISA). Для простейших паразитов, таких как Cryptosporidium parvum и ]Giardia lamblia , иммунофлюоресцентное окрашивание в сочетании с микроскопией является золотым стандартом, но методы на основе ELISA, которые обнаруживают белки стенок ооциста, предлагают более быстрый инструмент скрининга для больших наборов образцов.

Химические загрязнители: пестициды и гербициды

Конкурентные наборы ELISA коммерчески доступны для десятков пестицидов, включая атразин, глифосат, хлорпирифос и карбарил. Эти анализы используются водоканалами и регулирующими органами для скрининга превышений MCL. Например, EPA США подтвердило предельные значения детектирования атразина ELISA (метод EPA 536.0), который достигает пределов обнаружения 0,1 мкг / л - значительно ниже MCL 3 мкг / л. Специфика антител позволяет дифференцировать исходные соединения и их метаболиты, что имеет решающее значение для точной оценки риска.

Тяжелые металлы и металлоиды

В ELISA для тяжелых металлов используются антитела, полученные против хелатных комплексов металлов. Доступны наборы для ртути (Hg2+), свинца (Pb2+), кадмия (Cd2+) и хрома (Cr6+) с ограничениями обнаружения в низком диапазоне ppb. Хотя ELISA не может соответствовать многоэлементной способности ICP-MS, он служит быстрым, недорогим инструментом скрининга для выявления загрязненных скважин или промышленных точек сброса до развертывания подтверждающего анализа.

Фармацевтические препараты и эндокринно-разрушающие соединения

С растущей озабоченностью по поводу следовых фармацевтических препаратов в водном цикле, ELISA был адаптирован для обнаружения антибиотиков (например, сульфаметоксазола, ципрофлоксацина), гормонов (17β-эстрадиола) и бисфенола А. Эти анализы помогают исследователям изучать судьбу загрязняющих веществ на очистных сооружениях и поверхностных водах. пропускная способность ELISA особенно выгодна для сезонных программ мониторинга или при отборе проб на нескольких участках.

Ограничения и вызовы

Ни один аналитический метод не является совершенным, и пользователи ELISA должны знать о его ограничениях. Кросс-реактивность является основной проблемой: антитела, поднятые против мишени, могут также связывать структурно связанные соединения, что приводит к ложным срабатываниям или переоценке уровней загрязнения. Для каждой новой матрицы необходима правильная валидация против подтверждающих методов (например, LC-MS / MS). Матричная интерференция от гуминовых кислот, высокая мутность или экстремальный pH могут подавлять сигнал или вызывать неспецифическое связывание. Разведение образца, оптимизация блокировки и использование стандартов, соответствующих матрице, смягчают эти эффекты.

Пределы обнаружения некоторых химических загрязнителей, особенно полярных или низкомолекулярных соединений, остаются выше, чем те, которые достижимы инструментальными методами. Для этих анализируемых лучше всего использовать ELISA в качестве инструмента скрининга, при этом положительные результаты подтверждаются вторичным методом. Срок годности реагентов (обычно 12-24 месяца в холодильнике) и периодичность вариабельности антител к партиям также могут влиять на долгосрочную согласованность мониторинга.

Будущие направления и инновации

Микрофлюидика и Lab-on-a-Chip ELISA

Интеграция ELISA в микрофлюидные устройства снижает потребление реагентов до объемов микролитра, сокращает время диффузии и позволяет автоматизировать многоступенчатые рабочие процессы. Считыватели на основе смартфонов, которые захватывают и анализируют колориметрические или флуоресцентные сигналы, приносят количественную способность ELISA к сбору образцов. Полевые испытания продемонстрировали успешное обнаружение E. coli и ионов свинца в питьевой воде с стоимостью устройства менее 100 долларов США.

Мультиплексные массивы и бисерные анализы

Платформы ELISA на основе бисера (такие как Luminex xMAP) могут одновременно количественно определять до 100 аналитов из одного образца воды с использованием спектрально различных бусин. Эта технология используется для комплексных панелей качества воды, которые включают бактерии, вирусы, пестициды и тяжелые металлы в одном анализе, резко увеличивая выход информации на образец.

Интеграция с биосенсорами и интеллектуальным мониторингом

Комбинирование ELISA с электрохимическими, акустическими или оптическими биосенсорами обеспечивает считывание в реальном времени или почти в реальном времени без необходимости считывания пластин. Например, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) ELISA может обнаружить атразин за 10 минут без шагов промывки. Будущие буи качества воды могут включать такие биосенсоры для непрерывного удаленного мониторинга исходных вод.

Машинное обучение для интерпретации данных

Инструменты искусственного интеллекта применяются к данным ELISA для коррекции матричных эффектов, оптимизации условий анализа и повышения точности количественной оценки. Нейронные сети, обученные на больших наборах данных образцов воды с шипами, могут отмечать аномальные реакции, которые могут указывать на интерференцию или деградацию антител, повышая надежность высокопроизводительных программ скрининга.

Устойчивое развитие реагентов

Предпринимаются усилия по замене традиционных антител животного происхождения рекомбинантными антителами, нанотелами и аптамерами. Эти синтетические связующие вещества более стабильны, имеют более длительный срок хранения и могут быть получены без этических проблем. Уже выпущен первый коммерческий препарат на основе аптамера ELISA для мониторинга воды (для микроцистина-LR).

Заключение

Анализ иммуносорбента, связанный с ферментом, превратился из рабочей лошадки клинической диагностики в универсальный и важный компонент инструментария мониторинга качества воды. Его способность предоставлять быстрые, чувствительные и конкретные результаты при умеренных затратах делает его особенно ценным для крупномасштабного скрининга, реагирования на вспышки и тестирования на местах использования в ограниченных ресурсами регионах. Хотя ELISA не является заменой подтверждающих инструментальных методов, ELISA служит защитой первой линии, позволяя менеджерам по воде выявлять события загрязнения на ранней стадии и ориентироваться на более ресурсоемкие анализы, где они наиболее необходимы. Текущие инновации в миниатюризации, мультиплексировании и интеллектуальном анализе данных обещают еще больше расширить возможности ELISA, усиливая глобальные усилия по обеспечению безопасной, чистой воды для всех.