Table of Contents

Проблема измерения быстрых реакций

Многие из важнейших химических и биологических процессов происходят на временных масштабах миллисекунд, микросекунд или даже быстрее. Ферментный катализ, реакция сворачивания белков, связывания лигандов и реакции переноса электронов разворачиваются в мгновение ока. Традиционные кинетические методы, которые опираются на ручное смешивание или пакетную выборку, не могут разрешить события, которые происходят быстрее, чем примерно за одну секунду. Для исследования сферы кинетики быстрой реакции ученые разработали набор методов быстрого смешивания, среди которых метод остановки потока выступает в качестве одного из самых универсальных и широко используемых инструментов. Путем сочетания быстрого смешивания со спектроскопическим обнаружением в реальном времени инструменты остановки потока позволяют исследователям фиксировать полный ход реакций с мертвым временем до одной миллисекунды.

Что такое технология Stopped-Flow?

Метод стоп-потока — это метод инициирования и наблюдения быстрых химических или биохимических реакций в контролируемых условиях. В простейшей форме два или более реагентных раствора загоняют из отдельных шприцев в смесительную камеру, где они собираются вместе и тщательно смешиваются в пределах доли миллисекунды. Затем смешанный раствор поступает в наблюдательную клетку, часто в небольшой кювет, и поток резко останавливается стоп-шприцем или клапаном. Сразу после остановки реакционная смесь эффективно «захватывается» в зоне наблюдения, и детектор записывает изменение некоторых физических свойств — таких как поглощение, флуоресценция или круговой дихроизм — как функция времени. Результатом является непрерывный кинетический след, который показывает прогресс реакции с самых ранних моментов.

Первоначально разработанный в 1940-х годах и усовершенствованный в течение последующих десятилетий, инструментарий с остановленным потоком эволюционировал от громоздких, управляемых вручную систем до компьютерных высокочувствительных устройств, способных к многоволновому обнаружению. Современные инструменты обычно достигают мертвого времени (время между смешиванием и началом сбора данных) от одной до двух миллисекунд, а специализированные микрофлюидные версии могут протолкнуть этот предел ниже 100 микросекунд.

Как работает остановленный поток?

Основной рабочий цикл инструмента с остановленным потоком можно разбить на несколько отдельных фаз:

  1. Загрузка: Реактантные растворы помещают в два или более приводных шприца. Эти шприцы обычно термостатируются для поддержания постоянной температуры.
  2. Вождение: Пневматическая или механическая система привода одновременно толкает шприцевые плунжеры вперед, заставляя реагенты через высокоскоростную трубку в небольшую камеру смешивания. Привод обычно быстрый и воспроизводимый, обеспечивая согласованные скорости потока.
  3. Смешивание:] Внутри смесительной камеры потоки реагентов турбулентно смешиваются.Обычные геометрии смесителя включают T-джеты, четырехструйные тангенциальные конструкции и шаровые смесители, каждый из которых оптимизирован для достижения полного смешивания в течение 100-500 микросекунд.
  4. Втекает в наблюдательную ячейку: Смешанный раствор проходит через наблюдательную ячейку — кювет небольшого объема с оптическими окнами.Объем ячейки обычно составляет долю миллилитра.
  5. Стоп и сбор данных: По мере того, как смесь заполняет наблюдательную ячейку и любой нижестоящий объем, она в конечном итоге толкает к стоп-шприцу. Когда стоп-шприц достигает заданного предела, переключатель запускает два события: поток останавливается, и начинается запись данных. Поскольку остановка происходит по существу мгновенно, реакционная смесь теперь неподвижна, и детектор начинает собирать кинетические данные.
  6. Стирайте и повторяйте: После сбора данных наблюдательная ячейка и камера смешивания промываются буфером или следующим образцом, и цикл повторяется для повторных измерений или различных условий.

Ключевые компоненты инструмента с остановленным потоком

Понимание роли каждого компонента помогает оценить силу и ограничения техники.

  • Шприцы и привод: Привод должен обеспечивать постоянную воспроизводимую скорость потока. Пневматические поршни распространены; шаговые двигатели используются в системах, требующих точного управления громкостью.
  • Смешивающая камера: Эффективность смешивания определяет время отмерения. Высококачественные смесители используют турбулентный поток в небольших каналах для достижения быстрой однородности. Мертвое время часто измеряют путем наблюдения реакции стандарта (например, уменьшение 2,6-дихлорфенолиндофенола аскорбиновой кислотой).
  • Наблюдение ячейки: Обычно кварцевый кювет длиной 1—10 мм, предназначенный для быстрого оптического доступа. Для измерений флуоресценции ячейка может иметь полированные окна под прямым углом.
  • Система обнаружения: Для контроля интенсивности света используются фотоумножители трубок (ПМТ) или фотодиодные массивы. Монохроматор или фильтр выбирает соответствующую длину волны. Современные приборы могут одновременно записывать несколько длин волн через диодные массивы или устройства с зарядовой связью (CCD).
  • Стоп шприц и триггер: Стоп шприц обеспечивает заданное обратное давление и действует как механический триггер.Оптический или электрический датчик обнаруживает остановку и начинает сбор данных с минимальной задержкой.
  • Контроль температуры: Весь путь жидкости — шприцы, смеситель и клетка — обычно заключен в блок с водяной рубашкой, соединенный с циркулирующей ванной для поддержания постоянной температуры (часто 20–25 °C, но может быть изменен).
  • Система сбора данных: Высокоскоростные аналого-цифровые преобразователи пробуют сигнал детектора со скоростью от килогерца до мегагерца, захватывая сотни или тысячи точек данных в секунду.

Измерение быстрой реакции кинетики с остановленным потоком

Извлечение констант ставок из транзитных данных

После получения необработанного кинетического следа — поглощения или флуоресценции по сравнению со временем — данные анализируются с использованием соответствующих кинетических моделей. Для простой реакции первого порядка, такой как неимолекулярная изомеризация белка, след следует за экспоненциальным распадом или повышением. Нелинейная подгонка наименьших квадратов дает наблюдаемую постоянную скорости k obs. Для бимолекулярных реакций наблюдаемая скорость зависит от концентрации; изменяя концентрацию одного реагента, константа скорости второго порядка может быть определена с наклона участка kobs против концентрации.

Более сложные механизмы, такие как двухэтапное связывание или ферментный катализ (кинетика Майклиса-Ментена), требуют глобального соответствия нескольких следов, собранных в разных условиях. Программные пакеты (например, KinTek, Biologic или инструменты с открытым исходным кодом, такие как QtiPlot) используются для соответствия интегрированным уравнениям скорости, полученным из предлагаемого механизма.

Важным параметром в экспериментах с остановленным потоком является мертвое время . Реакции, которые быстрее мертвого времени, уже будут прогрессировать до того, как будет записана первая точка данных. Это означает, что амплитуда быстрой фазы может быть недооценена, что потенциально приводит к ошибкам в кинетическом анализе. Мертвое время обычно измеряется с использованием известной быстрой реакции и обычно определяется производителем.

Методы обнаружения

Выбор метода обнаружения зависит от изучаемой реакции:

  • УФ-видимая абсорбция: Подходит для реакций, которые включают изменения концентраций хромофора — например, оборот субстрата в ферментах или связывание лиганда с изменениями абсорбции.
  • Флуоресценция: Гораздо более чувствительна, чем поглощение, идеально подходит для низких концентраций и для реакций, включающих внутренние или внешние фторфоры (например, триптофан в белках, дансиловые метки).
  • Циркулярный дихроизм (CD) и оптическая вращательная дисперсия (ORD): Используется для отслеживания изменений во вторичной структуре, таких как складывание или развертывание белка.
  • Светоразброс: Полезно для мониторинга реакций агрегации или полимеризации.
  • Электрохимическое обнаружение: Менее распространено, но возможно со специализированными клетками, которые включают электроды.

Преимущества и ограничения стоп-флоу

Преимущества

  • Высокое временное разрешение: Мертвое время 1—2 мс позволяет наблюдать быстрые процессы, за которыми не может следовать ручное смешивание.
  • Мониторинг в реальном времени: Непрерывные следы обеспечивают полные кинетические профили, а не только измерения конечных точек.
  • Минимальное потребление образцов: Типичные общие объемы за эксперимент составляют 50-200 мкл, и несколько повторов могут быть выполнены с небольшими общими количествами.
  • Совместимость: Совместим с широким спектром режимов обнаружения и типов образцов — растворов, суспензий и даже некоторых мембранных препаратов.
  • Контроль температуры: Вся система может быть термостатирована, что позволяет проводить исследования температурной зависимости и анализ Аррениуса.

Ограничения

  • Мертвый временной предел: Реакции быстрее ~1 мс не могут быть полностью разрешены; начальный всплеск теряется. Для субмиллисекундной кинетики необходимы другие методы, такие как фотолиз вспышки или методы непрерывного потока.
  • Смешивание артефактов: Неполное или невоспроизводимое смешивание может привести к исходным искажениям или ложным сигналам.Тщательная калибровка и выбор геометрии смесителя имеют важное значение.
  • Оптические артефакты: Изменения показателя преломления при смешивании могут вызывать базовые скачки, особенно при смешивании растворов разных композиций.
  • Эффекты, вызванные потоком: Высокие силы сдвига во время смешивания могут возмущать некоторые тонкие макромолекулярные сборки, хотя это редко является проблемой для большинства небольших белков и ферментов.
  • Ограниченный раствор-фаза: Остановочный поток в основном предназначен для жидких образцов; твердые или очень вязкие образцы являются сложными.

Применение остановленного потока в науке

Энзимная кинетика и механизм

Спектроскопия с остановленным потоком является краеугольным камнем механической ферментологии. Путем смешивания фермента с его субстратом и мониторинга образования продукта или поглощения кофактора исследователи могут определить константы скорости предварительного устойчивого состояния, которые показывают отдельные этапы каталитического цикла. Например, всплеск образования продукта в первые несколько миллисекунд реакции может указывать на шаг высвобождения продукта, ограничивающий скорость, - ключевое понимание для понимания эффективности фермента и ингибирования. Классические исследования химотрипсина и алкогольдегидрогеназы в значительной степени полагались на остановленный поток для измерения преходящего фосфорилирования или связывания NADH.

Складка и разворачивание белка

Изучение динамики сворачивания белка требует быстрого начала реакции сворачивания. В типичном эксперименте с сворачиванием с остановленным потоком раствор развернутого белка (например, в высокой концентрации денатуранта) быстро смешивается с большим избытком буфера, не содержащего денатуранта, вызывая сворачивание. Флуоресценция из остатков триптофана или внешних красителей сообщает о структурных изменениях. Кинетические следы сворачивания часто показывают несколько экспоненциальных фаз, выявляя наличие промежуточных состояний. Остановочный поток сыграл важную роль в картировании путей сворачивания небольших шаровых белков, таких как барназа , убиквитин и цитохром c.

Обязательная связь с лигандами и открытие наркотиков

Измерение скорости ассоциации и диссоциации лекарств или природных лигандов от их целей имеет решающее значение в фармакологии. флуоресценция с остановленным потоком может разрешать события связывания, которые происходят на субсекундных временных масштабах. Методика помогает определить, следует ли связывание простому бимолекулярному механизму или включает этап конформационных изменений (индуцированная посадка). Такая информация направляет разработку лекарств с оптимизированными показателями и без них. Отличный обзор приложений с остановленным потоком в открытии лекарств можно найти в в этой перспективе журнала медицинской химии .

Быстрые химические реакции

В неорганической и органометаллической химии для изучения переноса электронов, замещения лигандов и каталитических циклов используется остановленный поток. Например, кинетика связывания кислорода с переходными металлическими комплексами часто слишком быстра для обычных методов. Путем смешивания восстановленного металлического комплекса с кислороднасыщенным раствором в остановленном потоке можно контролировать образование металлооксопромежуточных соединений. Аналогично механизм каталитической гидрирования или полимеризации можно рассечь, наблюдая ранние стадии реакции.

Конформационные изменения биологических макромолекул

Помимо сворачивания белка, многие биологические функции включают конформационные переходы, вызванные связыванием лиганда, изменением рН или температурным скачком. Остановочный поток в сочетании с круговым дихроизмом или FRET (передача резонансной энергии Фёрстера) может разрешать эти движения. Также была продемонстрирована применимость остановленного потока к сворачиванию РНК и ДНК, особенно для рибосвитеров и рибозимов.

Последние достижения в технологии остановки потока

Микрофлюидный стоп-флук

Интеграция принципов остановленного потока в микрофлюидные чипы подтолкнула мертвые времена ниже 100 мкс. В микрофлюидных устройствах ламинарное смешивание усиливается хаотичной адвекцией с использованием специализированных канальных геометрий. Эти системы потребляют еще более низкие объемы выборки (нанолитры) и могут быть массивированы для высокопроизводительного кинетического скрининга. Исследовательские группы использовали микрофлюидный стоп-поток для изучения быстрой кинетики ферментов и сворачивания белка с беспрецедентным временным разрешением. Примечательным обзором является эта лаборатория на статье Chip о микрофлюидном быстром смешивании .

Остановившийся поток высокого давления

Для изучения влияния давления на скорости реакции и объемы активации приспособлены инструменты остановки потока для работы при высоких гидростатических давлениях (до нескольких сотен МПа). Такие системы неоценимы для понимания стабильности белков и механизмов ферментативных реакций в экстремальных условиях, встречающихся в глубоководных средах или промышленных реакторах.

Крио-остановка потока

Субнулевая температура остановленного потока (часто называемая крио-остановленным потоком) позволяет исследователям замедлять быстрые реакции, достаточное для обнаружения мимолетных промежуточных продуктов. Используя криорастворители (например, смеси воды с диметилсульфоксидом или метанолом) и работая при температурах до −40 °C, скорости многих реакций снижаются на порядки величины. Этот подход был особенно успешным в улавливании и характеристике промежуточных продуктов в ферментном катализе и фотохимических реакциях.

Сравнение с другими быстрыми кинетиками

Остановить поток — один из нескольких методов изучения быстрых реакций; каждый имеет свои сильные стороны и ограничения:

  • Непрерывный поток: Реагенты протекают через длинную трубку, и данные измеряются в разных положениях вдоль трубки, соответствующих различным временам после смешивания. Непрерывный поток предлагает очень короткие мертвые времена (микросекунды), но потребляет большие объемы образца. Напротив, остановленный поток использует меньше образца и проще для реализации.
  • Флэш-фотолиз/лазерный фотолиз: Использует короткий лазерный импульс для запуска реакции (например, диссоциации соединения в клетке). Он обеспечивает изысканное разрешение по времени (пикосекунды), но требует фотолабильного триггера. Остановочный поток более общий для любой реакции, которая может быть инициирована путем смешивания.
  • Температурный прыжок (T-прыжок): Быстрое повышение температуры, вызванное лазером или разрядом (несколько градусов в наносекундах), расслабляет равновесие, и наблюдается возврат к равновесию. T-прыжок отлично подходит для изучения быстрых конформационных изменений, но ограничен системами с крутой температурной зависимостью равновесия. Stopped-flow более гибок для изучения концентрационно-зависимых процессов.
  • Ускоренный поток: После смешивания и определенной задержки реакция угасает путем добавления жесткого реагента (например, кислоты) и продукты анализируются в автономном режиме.Укороченный поток может получить доступ к очень ранним точкам времени, но не обеспечивает непрерывные данные в реальном времени; остановленный поток делает.

Практические соображения для создания эксперимента с остановленным потоком

Получение надежных кинетических данных с помощью инструмента остановки потока требует тщательного изучения экспериментальной конструкции:

  • Выбор буферной и ионной прочности: Решения должны фильтроваться и дегазироваться, чтобы избежать пузырьков воздуха, которые могут вызывать артефакты. Различия вязкости между реагентами должны быть сведены к минимуму, чтобы обеспечить хорошее смешивание.
  • Определение мертвого времени: Всегда измеряйте мертвое время вашего инструмента в тех же условиях потока, что и в вашем эксперименте, используя стандартную реакцию (например, реакцию между DCPIP и аскорбатом).
  • Контролировать эксперименты: Запустить «только поток» управление (смешивание одного и того же раствора с самим собой) для проверки стабильности исходного уровня. Также, убедитесь, что реакция не ограничена смешиванием артефактов путем сравнения результатов при разных скоростях потока.
  • Усреднение данных: Обычно 5-10 реплик усредняются для улучшения сигнал-шум. Однако убедитесь, что реакция воспроизводима и что во время повторных экспериментов не происходит фотоотбеливания или деградации образца.
  • Контроль температуры: Поддерживает стабильную температуру на протяжении всего процесса. Для температурочувствительных реакций даже дрейф на 1 °C может значительно изменять константы скорости.

Заключение

Методы остановки потока произвели революцию в изучении кинетики быстрых реакций, позволив исследователям наблюдать процессы, которые когда-то были скрыты за миллисекундным барьером. От фундаментальных идей о механизмах ферментов и сворачивания белка до практических применений в области открытия лекарств и материаловедения, остановка потока остается незаменимым инструментом в арсенале химика и биохимика. По мере того, как приборы продолжают развиваться - с микрофлюидами, вариантами высокого давления и многоволновым обнаружением - объем систем, доступных для анализа остановки потока, будет только расти. Для любого ученого, стремящегося понять динамическое поведение молекул в растворе, освоение метода остановки потока является мощным шагом вперед.

Для дальнейшего чтения об основах кинетики остановленного потока см. классический текст Fersht, Структура и механизм в белковой науке или обзорная статья «Спектроскопия флуоресценции с остановленным потоком» в отчетах о химических исследованиях . Дополнительные технические детали по дизайну приборов можно найти на страницах производителя BioLogic или PROT-ON .