Table of Contents

Нейронные стволовые клетки (НСК) являются самообновляющимися, мультипотентными клетками, которые порождают основные типы клеток центральной нервной системы: нейроны, астроциты и олигодендроциты. Их уникальная способность к размножению и дифференциации делает их незаменимыми инструментами для биологии развития, моделирования заболеваний, скрининга лекарств и регенеративной медицины. Однако поддержание НСК в культуре при сохранении их стволовости и геномной стабильности требует тщательной оптимизации параметров окружающей среды и питания. Даже незначительные отклонения от оптимальных условий могут привести к спонтанной дифференциации, старению или потере пролиферативной способности. Эта статья обеспечивает всеобъемлющую основу для установления и уточнения протоколов культивирования нейронных стволовых клеток, опираясь на установленные передовые практики и последние достижения в этой области.

Понимание биологии и источников нейронных стволовых клеток

НСК могут быть выделены из эмбриональных, эмбриональных или взрослых нервных тканей. Эмбриональные НСК, полученные из теленцефалона или спинного мозга, обладают наибольшим пролиферативным потенциалом, в то время как взрослые НСК из субвентрикулярной зоны или гиппокампа демонстрируют более ограниченный рост. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC)-производные НСК предлагают масштабируемую, специфичную для пациента альтернативу. Независимо от источника, все культуры НСК имеют зависимость от конкретных сигнальных сред для поддержания их недифференцированного состояния.

Ключевые маркеры для характеристики НСК включают Nestin, Sox2 и Pax6 для нейронных предшественников и GFAP для радиальных глиа-подобных клеток у взрослого человека.Успешная культура поддерживает высокую экспрессию этих маркеров с минимальной экспрессией специфичных для линии маркеров, таких как TUJ1 (нейроны) или O4 (олигодендроциты).

Основные экологические параметры

Температура и стабильность pH

NSC обычно культивируют при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Уровень CO2 работает с бикарбонатной буферной системой в среде для поддержания рН 7,2-7,4. Частые дверные проемы или колебания CO2 могут вызывать сдвиги рН, которые стрессируют клетки, что приводит к снижению жизнеспособности. Использование водяной ванны до предварительно теплой среды и реагентов до 37°C перед кормлением предотвращает тепловой удар.

Кислородная напряженность

Стандартные инкубаторы работают при атмосферном кислороде (~20% O2), но физиологические уровни кислорода в развивающемся и взрослом мозге колеблются от 1% до 5%. Было показано, что культивирование НСК в гипоксических условиях (2-5% O2) усиливает пролиферацию, уменьшает окислительный стресс и поддерживает мультипотентность. Выделенные гипоксические камеры или инкубаторы три-газа могут обеспечивать согласованные среды с низким содержанием кислорода. Для обычных культур использование антиоксидантных добавок, таких как N-ацетилцистеин или витамин Е, может частично компенсировать повреждающее действие нормоксии.

Влажность и обмен газа

Высокая влажность (≥95%) препятствует испарению культуральной среды, что в противном случае приводит к повышению осмолярности и концентрации ионов, которые ухудшают рост клеток. Многие инкубаторы включают в себя водопровод, и очень важно регулярно контролировать уровень воды и заменять стерильной водой. Не менее важен правильный газообмен; полностью избегать герметизации культуральных сосудов, если не использовать газопроницаемые колпачки или пленки.

Медиа-состав и формулы

Выбор базальной среды и добавок глубоко влияет на поведение НСК. Наиболее распространенными составами являются нейробазальная среда (разработанная для первичных нейронов) и DMEM/F12 (смесь 1:1 модифицированной орлиной среды Dulbecco и F12 Ham). Оба обеспечивают незаменимые аминокислоты, витамины и глюкозу. Однако НСК требуют специализированных добавок для поддержки своих уникальных метаболических потребностей.

Базовые СМИ

  • Нейробазальная средняя — содержит более низкие уровни глутамина и более высокие концентрации добавок B27, предназначенных для нейронных культур. Часто используется для постдифференциации, но может быть адаптирована для поддержания НСК в сочетании с факторами роста.
  • DMEM/F12 — более богат питательными веществами и обычно используется для плода и ИПСК-производных культур НСК. Многие опубликованные протоколы для невросферы и монослойных культур предпочитают DMEM/F12 в качестве основы.
  • Таможенные формулы — Некоторые лаборатории разрабатывают свободные от сыворотки, определенные среды с точно контролируемыми концентрациями инсулина, трансферрина, селена и прогестерона (например, N2 или B27).

Факторы роста

Два критических митогена для культуры НСК — эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF или FGF-2). Обычно добавляют по 10-20 нг/мл каждый, они активируют рецепторные тирозинкиназы, которые способствуют вхождению в клеточный цикл и предотвращают апоптоз. В некоторых протоколах используется только один фактор, но комбинация обычно дает более высокие скорости расширения. Крайне важно использовать рекомбинантные, безжизненные факторы роста, чтобы избежать изменчивости и потенциальных загрязнителей.

Сыворотка и добавки

Сыворотка крупного рогатого скота (FBS) не рекомендуется для поддержания недифференцированных НСК, поскольку она содержит факторы, вызывающие дифференцировку.

  • B27 Добавка (50×) — содержит антиоксиданты (каталаза, супероксиддисмутаза), жирные кислоты и гормоны. Первоначально она была разработана для выживания нейронов, но хорошо работает для расширения НСК в сочетании с факторами роста.
  • N2 Дополнение (100×) — содержит инсулин, трансферрин, прогестерон, гутрескин и селенит. Он менее сложен, чем B27 и часто используется с DMEM/F12 для культуры невросферы.
  • GlutaMAX или L-глутамин — Глутамин необходим для клеточного метаболизма, но со временем деградирует; GlutaMAX обеспечивает более стабильную форму дипептида.

Антибиотики и антимикотики

Обычное применение пенициллина-стрептомицина (100 U/мл), но длительное воздействие может маскировать загрязнение и влиять на поведение клеток. Для критических экспериментов рассмотрим культуры без антибиотиков со строгой асептической техникой. Если грибковое загрязнение представляет собой риск, можно добавить амфотерицин B или грибок, но эти соединения могут быть токсичными для НСК в высоких концентрациях.

Подстраты и оптимизация поверхности

Двумерная монослойная культура

Для адептов культур NSC поверхность должна быть покрыта для содействия прикреплению и выживанию клеток. Золотой стандарт представляет собой последовательное покрытие с поли-L-орнитином (PLO) , за которым следует ламинином . PLO обеспечивает положительно заряженную поверхность для электростатического связывания, в то время как ламинин участвует в рецепторах интегрина, которые поддерживают адгезию и пролиферацию. Типичные концентрации: PLO при 10-20 мкг/мл в воде (ночная инкубация) и ламинин при 1-5 мкг/мл в PBS или культуральной среде (2-4 часа). Ламинин, полученный из саркомы мыши Энгельбрета-Холма (EHS) мыши, наиболее распространен; однако теперь доступны рекомбинантные изоформы ламинина человека (такие как LN-521) и уменьшают пакетную вариабилитность.

Покрытия можно заменить фибронектином или матригелем, но они вводят неопределенные компоненты. Для высокопроизводительного скрининга разрабатываются синтетические пептидные покрытия (например, с мотивами RGD или IKVAV).

Трехмерная культура невросферы

Нейросферы представляют собой свободно плавающие агрегаты НСК, не требующие субстрата. Эта система полезна для поддержания стволовости и для клонального расширения. Однако невроферы могут развивать некротические центры, если они становятся слишком большими (>200 мкм в диаметре). Чтобы этого избежать, разъединяйте сферы каждые 5-7 дней с помощью ферментативных методов (Аккутазы или трипсина-ЭДТА) и мягкой механической тритурации. Сферы должны проходить до того, как они превысят 200 мкм для поддержания жизнеспособности.

Скаффолдс и Гидрогели

Для применения в тканевой инженерии НСК часто встраиваются в биомиметические каркасы, такие как альгинат, коллаген или гидрогели гиалуроновой кислоты. Эти 3D-среды лучше повторяют нативный внеклеточный матрикс и могут быть настроены на жесткость, пористость и представление лиганда. Оптимальная жесткость для культуры НСК обычно находится в диапазоне 0,1-1 кПа, имитируя ткань мозга. Более жесткие субстраты, как правило, способствуют дифференцировке глиев.

Поддержание стеблеспособности и предотвращение спонтанной дифференциации

Пассивная стратегия

НСК должны проходить при 70-80% слиянии (монослое) или при достижении невросферами 150-200 мкм. Пересечение вызывает контактно-индуцированную дифференцировку и снижает жизнеспособность клеток. Используйте щадящий метод диссоциации: Аккутаза мягче трипсина и сохраняет поверхностные маркеры. После диссоциации клетки пересеиваются при плотности 2-5×104 клеток/см2 для монослоя или 1×105 клеток/мл для невросфер. Более низкая плотность благоприятствует пролиферации; более высокая плотность может индуцировать дифференцировку даже при наличии факторов роста.

Ингибиторы дифференциации

Несколько небольших молекул могут помочь поддерживать состояние предшественника при использовании наряду с факторами роста:

  • Ингибитор киназы, связанный с ROCK (Y-27632 (10 мкМ): улучшает выживаемость диссоциированных одиночных клеток и уменьшает аноики.
  • Ингибиторы сигнализации SMAD (например, SB431542, LDN–193189): В основном используются в нейронной индукции iPSC, но могут быть добавлены к определенным линиям NSC.
  • Ингибиторы GSK-3 (например, CHIR99021): активировать сигнализацию Wnt, которая может способствовать пролиферации в некоторых подтипах NSC, но тщательная титрование имеет важное значение для предотвращения смещения линии.

Гипоксия как фактор стойкости

Как упоминалось ранее, низкое кислородное напряжение (2-5% O2) активирует гипоксии-индуцируемые факторы (HIF-1α и HIF-2α), которые повышают регуляции генов ствола, таких как Sox2 и Notch1. Гипоксия также снижает реактивные виды кислорода (ROS), которые в противном случае могут вызвать повреждение ДНК и старение. Если выделенный низкокислородный инкубатор недоступен, рассмотрите возможность использования химических миметиков, таких как кобальт хлорид (CoCl2) или дефероксамин, но они имеют нецелевые эффекты.

Контроль качества и характеристика

Регулярный мониторинг культур НСК обеспечивает последовательность и воспроизводимость. К числу основных мер контроля качества относятся:

  • Морфологический осмотр: Здоровые НСК в монослое показывают биполярную или многополярную морфологию с фазово-яркими телами клеток. Нейросферы должны быть круглыми с гладкими краями. Гранульный вид или гало указывают на дифференцировку.
  • Иммуноцитохимия:] Пятно для Нестина (незрелый нейронный предшественник), Sox2 (плюрипотентность/нейронная стволовость) и Ki-67 (пролиферация). Культуры с низким проходом должны иметь >90% нестин-положительных клеток.
  • Цитометрия потока: Определить поверхностные маркеры, такие как CD133 (проминин-1) и CD15 (SSEA-1).
  • Кариотипирование: Кариотипирование: Выполняйте с регулярными интервалами (например, каждые 10 пассажей) для выявления хромосомных аномалий, которые могут возникать спонтанно.
  • Микоплазма тестирование: Используйте наборы на основе ПЦР каждый месяц.Микоплазма инфекция сильно изменяет поведение клеток и может остаться незамеченным.

Устранение общих проблем

Плохая клеточная привязанность

Если клетки отсоединяются в течение 24 часов, проверьте качество покрытия. Убедитесь, что растворы PLO и ламинина свежие и стерильные. Проверьте, что pH раствора покрытия является подходящим (ламинин лучше всего работает при pH 7.2-7.4). Рассмотрите возможность использования рекомбинантного ламинина, который имеет тенденцию давать более согласованные результаты.

Низкое распространение

Медленный рост может быть результатом исчерпанных факторов роста - добавляйте свежий EGF/bFGF каждые 2-3 дня. Проверяйте микоплазму. Если клетки используются для снижения кислорода, перенос их в стандартные условия может замедлить рост. Увеличьте плотность посева постепенно, но избегайте высокой плотности, которая вызывает ингибирование контакта.

Спонтанная дифференциация

Дифференциация часто проявляется как длинные, разветвленные процессы или клеточные скопления с уплощенными клетками. Уменьшите слияние, проходя раньше. Удалите любую сыворотку или нехарактеризованные добавки. Если использовать невросферы, избегайте их роста слишком большими. Некоторые линии НСК требуют добавления лиганда Notch DLL4 для поддержания ствола; рассмотрите возможность добавления активатора Notch.

загрязнение

Бактериальное или грибковое загрязнение обычно очевидно (облачная среда, падение рН). Для его предотвращения всегда фильтруйте факторы роста через фильтры 0,22 мкм, используйте стерильные методы и изолируйте инкубатор. Для упрямого загрязнения добавляйте антибиотики выборочно, но культивируйте несколько проходов в безбактериальной среде после этого, чтобы обеспечить чистые линии.

Протоколы дифференциации (краткий обзор)

Хотя в этой статье основное внимание уделяется поддержанию недифференцированных НСК, важно знать, как индуцировать дифференцировку для характеристики или применения. Для нейрональной дифференциации , удалить EGF и bFGF и добавить нейротрофины, такие как нейротрофический фактор мозга (BDNF, 10 нг/мл) и глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Культивирование на покрытых ламининовой оболочкой поверхностях с низкой сывороткой (0,5% FBS) может стимулировать рост нейрита. Для астроцитной дифференциации , дополнить среду цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF) или костными морфогенетическими белками (BMPs). Для олигодендроцитной дифференциации , использовать трийодтиронин (T3)

Будущие перспективы и приложения

Достижения в оптимизации культуры позволяют создавать более воспроизводимые и физиологически релевантные модели НСК. Использование химически определенных, не содержащих ксеноновых сред снижает пакетные эффекты и поддерживает клинический перевод. Микрофлюидные платформы теперь позволяют динамически контролировать градиенты кислорода и питательных веществ, имитируя нейрососудистую нишу. Отредактированные НСК CRISPR используются для моделирования генетических заболеваний и доставки терапевтических полезных нагрузок. Для недавнего обзора передовых методов культуры НСК см. эта статья в Cell .

Кроме того, для промышленного применения было разработано крупномасштабное расширение биореакторов с перемешанными резервуарами с микроносителями. Эти системы требуют тщательного мониторинга сдвига напряжения и переноса газа, но могут производить миллиарды НСК для исследований трансплантации. Руководство FDA по продуктам стволовых клеток человека подчеркивает необходимость надежных качественных атрибутов, что делает оптимизированные условия культуры нормативной предпосылкой.

Заключение

Оптимизация условий культуры для нервных стволовых клеток является многогранной задачей, которая требует внимания к каждой детали, от выбора базальной среды и факторов роста до контроля напряжения кислорода и жесткости субстрата. Поддерживая свободные от стресса среды, имитирующие развивающийся мозг, исследователи могут сохранить самообновление НСК, геномную стабильность и потенциал дифференциации. Регулярная характеристика и устранение неполадок дополнительно гарантируют, что экспериментальные результаты значимы и воспроизводимы. По мере созревания области эти стратегии оптимизации будут продолжать развиваться, подкрепляя прорывы в нейронауке и регенеративной медицине.