Поддержание стерильности в лабораториях клеточной культуры имеет основополагающее значение для воспроизводимости и обоснованности экспериментальных результатов. События загрязнения, будь то бактериальные, грибковые, микоплазменные или кросс-клеточные, могут лишить законной силы недели или месяцы работы, тратить дорогостоящие реагенты и скомпрометировать целостность данных. Скорость загрязнения даже 5-10% может резко искажать результаты, делая невозможным различать эффекты лечения от артефакта. Поэтому строгое соблюдение проверенной стерильной техники не является факультативным - это краеугольный камень надежной науки о клеточной культуре. Эта статья представляет собой всеобъемлющую, основанную на фактических данных основу для сохранения стерильности на каждом этапе работы с клеточной культурой, от проектирования объекта и личной гигиены до рутинного мониторинга и реагирования на кризис.

Источники загрязнения в культуре клеток

Понимание того, откуда берутся загрязняющие вещества, является первым шагом на пути к профилактике. Первичные источники делятся на несколько категорий:

Персонал

Люди являются наиболее распространенным вектором загрязнения. Кожные чешуйки, дыхательные капли и стрижённые волосы могут переносить бактерии и грибки в рабочую зону. Даже одно нелюбимое прикосновение руки к крышке сосуда культуры может вводить споры Стафилококк или Аспергиллус.Правильное мытье рук и использование стерильных перчаток снижают этот риск, но они не устраняют его полностью. Движение — ходьба, разговоры, кашель — создает воздушные потоки, которые могут переносить микроорганизмы в открытые культуры.

Окружающая среда и качество воздуха

Лабораторный воздух содержит взвешенные частицы, в том числе споры микроорганизмов. Работа по культивированию клеток должна выполняться внутри сертифицированного шкафа биобезопасности II класса (BSC), который обеспечивает HEPA-фильтрированный воздух. Однако даже BSC может быть скомпрометирован, если обработка воздуха в помещении неадекватна или если шкаф расположен рядом с дверями, вентиляционными отверстиями или зонами с высоким трафиком. Другие экологические риски включают конденсацию на стенах инкубатора, стоячую воду в водяных ваннах и накопление пыли на полках и оборудовании.

Поставки и реагенты

Культурные среды, сыворотки, трипсин и антибиотики могут загрязняться во время производства, хранения или обработки. Хотя коммерческие носители стерильны, неправильное хранение, такое как оставление бутылок незавершенными или использование их после истечения срока годности, может позволить микробный рост. Грибковые споры в сыворотке являются печально известной причиной потери культуры. Вода, используемая для приготовления или очистки среды, должна быть стерильной; водопроводная вода, даже после дистилляции, может содержать эндотоксины или низкоуровневое бактериальное загрязнение.

Сотовые линии сами по себе

Загрязнение также может быть введено с клеточной линией. Микоплазма является наиболее коварным загрязнителем, потому что она не производит видимую мутность или изменение рН. Исследования оценивают, что 15-35% клеточных культур в общем использовании являются микоплазма-положительными , часто без ведома исследователя.

«Загрязнение микоплазмой может изменить практически каждый изученный клеточный параметр, включая экспрессию генов, метаболизм и реакцию на лекарства. Тестирование каждой входящей клеточной линии и регулярно после этого имеет важное значение». — Руководство по культуре клеток корнинга

Основные практики для поддержания стерильности

Работа в сертифицированном кабинете биобезопасности (BSC)

BSC является единственным наиболее важным элементом оборудования для культивирования стерильных клеток. Он обеспечивает однонаправленный, HEPA-фильтрированный поток воздуха, который защищает как оператора, так и культуры. Для работы с культурой клеток стандартным является шкаф типа A2.

  • Сертификация и техническое обслуживание: Ежегодно (или чаще) сертифицированный квалифицированным специалистом BSC. Проверьте сигнализацию воздушного потока и целостность фильтра HEPA.
  • Правильное использование: Держите защелку на правильной высоте. Избегайте блокировки передней или задней решетки. Поместите все предметы в шкаф перед началом работы — как только воздушный поток будет установлен, избегайте быстрых движений рук, которые могут нарушить стерильное поле.
  • Погрузка и разгрузка: Дезинфицируйте все предметы (бутылки для медийных средств, наконечники пипетки, флаконы) 70% этанолом перед размещением их в BSC. Расположите материалы так, чтобы чистые участки (бутылки для медийных средств) были отделены от отходов (используемые пипетки).
  • Ультрафиолетовый свет: Многие шкафы имеют УФ-свет для дезактивации между применениями. Используйте его не менее 15 минут после работы, но обратите внимание, что УФ не является заменой поверхностной дезинфекции этанолом.

Гигиена рук и средства индивидуальной защиты

Даже при БСК руки оператора являются основным источником загрязнения. Тщательно мойте руки антимикробным мылом перед входом в зону культивирования клеток. Носите безпорошковые нитрильные или латексные перчатки, которые хорошо подходят. После надевания перчаток распыляйте их 70% этанолом и позвольте им высушиваться на воздухе; периодически повторяйте.

  • Перчатки меняются: Переключите перчатки немедленно, если они касаются чего-либо нестерильного — снаружи бутылки для СМИ, подлокотника стула, дверной ручки или вашего лица.
  • Лабораторные покрытия: Носите специальную лабораторную куртку, которая используется только в наборе клеточной культуры. Одноразовые крышки рукава могут добавить дополнительный барьер.
  • Маски для лица и покровы для волос: Хирургическая маска уменьшает сброс капель, а сетка для волос или фуфантовая шапка предотвращает попадание рыхлых волос в культуры. Для работы с высокой последовательности (например, первичные клетки или клетки для клинического использования) может быть целесообразным полный щит.

Стерильное оборудование и поставки

Каждый предмет, который вступает в контакт с культурами или средами, должен быть стерильным. Это включает в себя пипетки, наконечники пипетки (с фильтрами), колбы, центрифужные трубки и криовиалы. Используйте только сертифицированные стерильные одноразовые пластмассы; избегайте повторного использования одноразовых предметов. Для многоразовых стеклянных изделий, таких как бутылки для носителей или перемешивающие решетки, автоклавирование при 121 ° C в течение по крайней мере 20 минут является стандартным. Альтернативно, стерилизация сухим теплом (160° C в течение 2 часов) может использоваться для предметов, которые не выдерживают пар.

  • Средства массовой информации и добавки: Стерилизовать чувствительные к теплу компоненты (например, антибиотики, витамины, факторы роста) фильтрацией через фильтр 0,22 мкм. Предварительно нагреваемые носители следует использовать немедленно и не оставлять при 37°C в течение длительных периодов.
  • Вода: Для культивирования клеток используйте только воду USP-класса или воду, которая была деионизирована, а затем стерильная фильтрована. Избегайте дистиллированной воды из металлических тисков, которые могут вводить эндотоксины.
  • Управление инкубатором: Регулярно чистите инкубаторы — протирайте полки и сковороды с дезинфицирующим средством (например, 70% этанола или четвертичное соединение аммония). Используйте стерильную воду без меди в сковороде для ингибирования роста бактерий.

Минимизируйте открытые культурные суда

Каждый момент, когда культуральный сосуд открыт, он уязвим. Планируйте свой рабочий процесс , чтобы вы могли быстро и эффективно выполнять все манипуляции. Используйте асептический метод: удерживайте колпачки стерильным образом (не устанавливайте их на поверхность BSC), огненные шеи стеклянных бутылок (если используете стекло) и используйте быстрое, плавное движение при открытии и закрытии колб.

  • Работая партиями: При обработке нескольких культур, поражайте свою работу так, чтобы вы никогда не жонглировали одновременно несколькими открытыми колбами.
  • Пипеттинг: Используйте отдельную стерильную пипетку для каждого переноса жидкости. Никогда не окунайте одну и ту же пипетку в культуру, а затем обратно в медиа-акции.
  • Использование антибиотиков: В то время как пенициллин-стрептомицин или гентамицин могут подавлять некоторые бактериальные загрязнители, они не убивают микоплазму или грибки. Чрезмерная зависимость от антибиотиков также может маскировать низкоуровневое загрязнение. Наилучшая практика заключается в работе без антибиотиков для рутинной культуры и полагаться исключительно на стерильную технику.

Дезинфицировать рабочие поверхности и оборудование

До и после каждого рабочего сеанса очищайте все поверхности внутри BSC дезинфицирующим средством. 70% этанол является наиболее распространенным выбором, потому что он быстро испаряется и эффективен против многих бактерий и вирусов. Однако он не убивает все спорообразующие организмы; для более глубокого обеззараживания вращайтесь с спорообразующим дезинфицирующим средством (например, 10% отбеливателем, с последующим стерильным водой для удаления остатков).

  • Недельно глубокая очистка:] По крайней мере, один раз в неделю, убирайте все предметы из BSC и тщательно очищайте интерьер спорицидным очистителем, затем с 70% этанолом. Пусть шкаф работает не менее 10 минут после этого, чтобы очистить любые пары.
  • За пределами BSC: Регулярно дезинфицируйте скамейки, ручки инкубатора, микроскопические окуляры и компьютерные клавиатуры. Эти поверхности с высоким касанием являются частыми резервуарами для загрязняющих веществ.

Расширенные передовые практики для долгосрочной стерильности

Лабораторный дизайн и рабочий процесс

Физическая компоновка лаборатории клеточной культуры может либо помочь, либо препятствовать стерильности. В идеале лаборатория должна иметь выделенную «чистую» область, отдельную от общих микробиологических или молекулярно-биологических пространств. Позитивное давление воздуха в помещении клеточной культуры (относительно коридора) вытесняет воздух, предотвращая проникновение нефильтрованного воздуха. По возможности используйте фильтры HEPA в вентиляционной системе помещения.

  • Передвижение по комнате: Ограничьте доступ только к обученному персоналу. Не используйте комнату культивирования клеток в качестве проходной или складской зоны. Поместите табличку снаружи: «Лаборатория культуры клеток — только уполномоченный персонал — Не вводите, если у вас холодная или свежая рана».
  • Отдельные чистые и грязные потоки: В идеале должен быть «чистый коридор» для входа (одежда, хранение стерильных принадлежностей) и отдельный маршрут для удаления отходов.Хотя это роскошь во многих объектах, просто обозначение чистой скамейки и скамейки для хранения отходов в лаборатории может помочь.

Мониторинг и тестирование на загрязнение

Регулярный мониторинг необходим, даже если нет видимого загрязнения. Лаборатории клеточной культуры должны иметь план мониторинга загрязнения, который включает:

  • Микоплазменное тестирование: Используют ПЦР- или культуральные методы для обнаружения микоплазмы. Проверяйте все новые клеточные линии после получения и тестируйте установленные культуры ежемесячно. Многие основные объекты или коммерческие услуги предлагают надежное тестирование.
  • Бактериальный и грибковый скрининг: Прививайте небольшую аликоту культурального супернатанта (или отработанной среды) в триптический соевый бульон и тиогликоллатную среду. Инкубируйте при 30–37 °C в течение 14 дней; визуально ежедневно проверяйте на мутность.
  • Выбор проб поверхности: Поверхности Swab BSC, интерьеры инкубатора и скамейки с стерильным хлопковым тампоном, а затем наползают на пластины из агара крови. Инкубируйте и подсчитывайте колониеобразующие единицы для мониторинга эффективности вашего режима очистки.
  • Тестирование качества воздуха: Используйте оседания (открытые чашки Петри с агаром), оставленные внутри BSC и в комнате в течение 1-4 часов.

Обработка предполагаемого загрязнения

Несмотря на все усилия, загрязнение все еще может произойти.

  1. Изолируйте сосуд: Переместите загрязненную культуру в карантинную зону подальше от других культур. Не открывайте ее в главном БСК.
  2. Определить загрязнитель: Проверить морфологию с помощью микроскопии (бактерии могут быть стержнями или кокками; грибы показывают гифы).
  3. Попытка спасения (если критическая): Для микоплазмы используйте проверенный режим элиминации (например, лечение BM-циклином или плазмоцином). Для бактерий или грибов обеззараживание редко бывает успешным; обычно безопаснее отбросить культуру и получить свежий флакон из исходного запаса.
  4. Обеззараживание BSC и оборудования: Используйте спорицид или отбеливатель для тщательной очистки шкафа, инкубатора и любых предметов, которые могли быть подвергнуты воздействию.
  5. Документируйте событие: Запишите, что произошло, вероятный источник и корректирующие действия. Используйте эту информацию для улучшения протоколов.

Обучение и культура асептики

Самое дорогое оборудование в лаборатории клеточной культуры бесполезно, если техника оператора плоха. Начальное и постоянное обучение имеет решающее значение. Новый персонал должен наблюдаться при выполнении макетной работы по культуре (с использованием стерильной воды или пищевой краски вместо живых культур), прежде чем ему будет разрешено работать с клетками.

  • Дрилли и аудиты: Проводить периодические асептические аудиты техники — например, иметь опытный техник смотреть стажер и оценивать каждый шаг (мытье рук, загрузка BSC, пипетка, закрытие сосудов).
  • Чек-листы: Создайте ежедневный контрольный список, который включает в себя: «Я чистил BSC перед началом? Дезинфицируются ли перчатки? Все ли предметы помещаются в BSC перед привнесением культур?» Используйте его в качестве умственного переосмысления.
  • Руководство по открытой книге: Поместите ламинированную быстроссылочную карту в область BSC, суммируя ключевые шаги: мыть руки, распылять этанол, загружать материалы, открывать сосуд, переносить, закрывать сосуд, удалять, очищать.

Особые соображения для первичных клеток и стволовых клеток

Первичные клетки (например, человеческие фибробласты, гепатоциты) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) обычно более чувствительны и требуют еще более строгой стерильности. Они часто получены из образцов тканей, которые могут нести комменсальные организмы низкого уровня. Использование двойных антибиотиков (пенициллин-стрептомицин и гентамицин) чаще встречается для первичных культур, но только временно — когда клетки хорошо растут, переход к среде без антибиотиков. Для iPSCs, выполняйте ежедневные изменения среды в BSC и избегайте любого использования нестерильной воды в инкубаторах.

Инкубатор Гигиена и газоснабжение

Инкубатор представляет собой теплую, влажную среду, где процветают загрязняющие вещества. Регулярное техническое обслуживание включает еженедельное стирание полок и дверей, очистку сковороды водой с помощью дезинфицирующего средства ежемесячно и замену фильтров HEPA (если они оборудованы) в соответствии с рекомендациями производителя. Используйте сковородку с медной подошвой для воды или добавьте раствор сульфата меди (нетоксичный для клеток) для ингибирования роста микроорганизмов. Для поставок газа CO2 и N2 используйте стерильные фильтры (0,22 мкм) для предотвращения загрязнения из резервуаров или линий.

Заключение

Стерильность в культуре клеток - это непрерывная дисциплина, которая требует внимания к деталям на каждом этапе - от архитектурного дизайна лаборатории и качества воздуха до ежедневного мытья рук оператора и окончательного стирания шкафа биобезопасности. Путем выявления основных источников загрязнения, принятия надежных асептических практик, внедрения рутинного мониторинга и инвестирования в обучение персонала, исследователи могут значительно снизить риск потери ценных культур. Стоимость этих мер предосторожности - время, оборудование и материалы - намного меньше, чем стоимость повторения экспериментов или, что еще хуже, публикации невоспроизводимых результатов. Для дальнейшего чтения, Руководство по культуре клеток ATCC , Gibco Cell Culture Basics и Корнинг культуры клеток Лучшие практики предлагают отличные дополнительные детали. Поддержание стерильности - это основа, на которой построены все надежные эксперименты культуры клеток.