Новые тенденции в переработке вниз по течению для растительных биологических препаратов

В этой статье рассматриваются ключевые инновации, меняющие процесс переработки для растительных биопрепаратов, от новых методов добычи до автоматизации, передовой хроматографии, интеграции процессов и зеленой инженерии. Каждая тенденция поддерживается недавними исследованиями и промышленными тематическими исследованиями, предоставляя практическую дорожную карту для разработчиков процессов, биопроизводителей и регуляторных стратегов.

Достижения в технологиях экстракции

Первый шаг в растительных биопрепаратах DSP — извлечение целевого белка из растительной биомассы — представляет уникальные проблемы. Клетки растений содержат жесткие клеточные стенки, высокие уровни протеаз, фенольных соединений и других вторичных метаболитов, которые могут деградировать или модифицировать продукт. Традиционные методы экстракции, такие как механическое прессование, гомогенизация и выщелачивание на основе буфера, часто страдают от низких урожаев, чрезмерного напряжения сдвига и совместного извлечения примесей. Новые методы решают эти ограничения с большей селективностью и более мягкими условиями.

Водная двухфазная экстракция (ATPE)

Водная двухфазная экстракция получила тягу для систем на растительной основе. Используя две несмешивающиеся фазы на водной основе (например, полиэтиленгликоль и солевую или полимерную/полимерную системы), АТПЭ разделяет целевой белок на одну фазу, в то время как большинство загрязняющих веществ остаются в другой. Этот мягкий, неденатурирующий метод можно применять непосредственно к гомогенизированным растительным экстрактам, сочетая уточнение и раннюю очистку на одной стадии. Недавние исследования продемонстрировали АТПЭ для моноклональных антител, экспрессируемых в N. benthamiana , достигая выходов восстановления выше 90% со значительным снижением белков клеток-хозяев и пигментов.

Сверхкритическое извлечение жидкости

Экстракция сверхкритического углекислого газа (scCO2) предлагает экологически чистую альтернативу органическим растворителям для восстановления липофильных биопрепаратов или для обезжиривания растительного материала до водной экстракции. Путем регулирования давления и температуры scCO2 можно настроить на выборочный извлечение липидов, хлорофиллов и других неполярных примесей, оставляя целевой белок нетронутым. Хотя более распространена для небольших молекул, предварительная обработка scCO2 исследуется для растительных ферментов и вакцинных антигенов. Метод ценен для снижения нагрузки на нисходящую хроматографию и для улучшения срока хранения очищенных экстрактов.

Микроволновая и герметичная жидкостная экстракция

Экстракция с помощью микроволновой печи (MAE) и экстракция жидкости под давлением (PLE) используют контролируемое нагревание и давление для быстрого разрушения стенок клеток растений. Эти методы сокращают время экстракции от часов до минут и могут улучшить восстановление белка из непокорных тканей, таких как семена или корни. В сочетании с водными буферами, содержащими восстановители и ингибиторы протеазы, MAE и PLE показали перспективу для извлечения рекомбинантного гормона роста человека и терапевтических ферментов из трансгенного риса и кукурузы. Однако термическая деградация остается проблемой для термолабильных биопрепаратов, поэтому тщательная оптимизация температуры и времени пребывания имеет решающее значение.

Автоматизация и оптимизация процессов

Нисходящая обработка в биопроизводстве исторически была ориентирована на партии, с ручным вмешательством для упаковки колонн, подготовки буфера и обработки образцов. Биологическая промышленность на основе растений быстро внедряет автоматизацию для увеличения пропускной способности, воспроизводимости и соответствия текущей надлежащей производственной практике (cGMP).

Роботизированная обработка жидкостей и интегрированные рабочие клетки

Роботизированные платформы для разработки высокопроизводительных процессов теперь стандартны во многих лабораториях. Автоматизированные обработчики жидкостей могут выполнять протоколы проектирования экспериментов (DoE) в нескольких типах смол, условиях буфера и скоростях потока одновременно, создавая надежные операционные окна в дни, а не недели. В производственном масштабе интегрированные рабочие ячейки объединяют модули центрифугирования, фильтрации и хроматографии под одной системой управления. Эти системы уменьшают ручные ошибки, позволяют вести журнал данных в реальном времени и облегчают без присмотра работу во время длительных прогонов очистки.

Процессно-аналитическая технология (PAT) и мониторинг в реальном времени

Применение технологии анализа процессов (PAT) трансформирует DSP из подхода «черного ящика» в прозрачную, богатую данными операцию. Встроенные в ряд ближние инфракрасные (NIR) и рамановские спектроскопические зонды могут измерять концентрацию белка, агрегированные уровни и профили примесей в режиме реального времени. Для растительных биопрепаратов PAT особенно полезен для обнаружения колебаний качества корма, вызванных изменчивостью роста растений. В сочетании с многовариантным анализом данных PAT позволяет динамически регулировать градиенты хроматографии или скорости потока фильтрации, обеспечивая неизменное качество продукта даже при изменении исходного материала.

Непрерывная обработка

Переход от пакетной к непрерывной нисходящей обработке является мегатенденцией в биофармацевтической промышленности, и растительные биологические препараты не являются исключением. Системы непрерывной хроматографии, такие как периодическая противотоковая хроматография (PCC) и моделируемые системы движущегося слоя (SMB), увеличивают использование смолы, уменьшают потребление буфера и обеспечивают постоянную работу. В непрерывном режиме этап захвата (обычно сродство белка А или ионный обмен) выполняется последовательно с двумя или более колонками, позволяя загружать одну колонну, в то время как другая элюируется и регенерируется. Результатом является 2-3-кратное увеличение производительности на единицу смолы. Для растительных биопрепаратов непрерывная обработка также помогает управлять быстрой деградацией белков в сырых экстрактах путем минимизации времени удержания.

Использование методов аффинности и хроматографии

Хроматография остается рабочей лошадкой биологической очистки. Для растительных продуктов подбор адсорбентов должен учитывать наличие специфических для растений загрязняющих веществ, таких как хлорофилл, полисахариды и алкалоиды. К числу новых тенденций относятся разработка лигандов с аффинностью, адаптированных к растениям, мембранная хроматография и многофункциональные смолы смешанного режима.

Лиганды растительного происхождения

Традиционные лиганды аффинности, такие как протеин А для захвата антител, дороги и могут выщелачиваться в продукт. Для растительных антител исследователи разработали специальные лиганды, которые распознают гликановые структуры, уникальные для систем экспрессии растений (например, бета-1,2-ксилоза и альфа-1,3-фукоза). Эти лиганды обеспечивают высокую селективность, избегая перекрестной реактивности с белками клеток-хозяев млекопитающих. Аналогичным образом, аффинные лиганды на основе пептидов и аптамеров разрабатываются для других классов растительных биологических препаратов, включая цитокины и факторы роста. Тенденция к полностью синтетическим, специфическим для растений смолам аффинности снижает стоимость и улучшает чистоту на одном этапе захвата.

Мембранная хроматография и монолитные колонны

Традиционные упакованные колонны хроматографии страдают от высоких перепадов давления и ограниченных скоростей потока при обработке вязких или нагруженных твердыми частицами растительных экстрактов. Адсорберы мембраны — пористые листы регенерированной целлюлозы или полиэтериссульфона, функционализированные с ионообменными или аффинными группами — предлагают конвективный механизм переноса массы, который позволяет обрабатывать при гораздо более высоких скоростях потока с более низким давлением. Мембранная хроматография особенно эффективна для стадии проточного полировки, где не требуется высокая емкость для загрязняющих веществ. Монолитические колонны, которые состоят из одного куска пористого полимера, обеспечивают аналогичные преимущества для быстрой очистки больших объемов и все чаще используются для вирусных наночастиц растительного происхождения и вирусоподобных частиц.

Смешанная и мультимодальная хроматография

Смешанные смолы сочетают два или более типа взаимодействия (например, ионообмен и гидрофобное взаимодействие) на одном лиганде. Эта ортогональная селективность может разрешать виды, которые трудно отделить с помощью однорежимной хроматографии. Для растительных экстрактов смешанные смолы, такие как Capto MMC или Nuvia cPrime, демонстрируют отличную способность удалять нуклеиновые кислоты, эндотоксины и цветные пигменты, сохраняя при этом высокую регенерацию целевого белка. Тенденция к мультимодальным скрининговым библиотекам, где параллельно тестируются десятки химий смол, позволяет быстро идентифицировать оптимальные условия для каждого биологического кандидата на основе растений.

Интеграция шагов Downstream

Традиционный DSP включает в себя линейную последовательность операций дискретных блоков: уточнение, захват, промежуточная очистка, полировка и формулировка. Каждый шаг вводит потерю продукта, разбавление и задержки во времени. Интенсификация процесса посредством интеграции шагов является ключевой новой тенденцией, которая снижает эти неэффективности.

Непрерывный захват с прямым кормом

Такие системы, как BioSC® от Novasep или ÄKTATM pcc от Cytiva, позволяют подавать колонку захвата непосредственно с предварительно отфильтрованным, но не полностью очищенным растительным экстрактом. Используя защитную колонку или фильтр глубины перед колонкой захвата, эти системы могут переносить некоторые твердые частицы, устраняя отдельный этап центрифугирования или микрофильтрации. Прямое соединение экстракции и захвата сокращает общее время обработки и минимизирует воздействие протеаз растений.

Внутренняя фильтрация и кондиционирование

Вместо сбора элюатов в резервуарах и последующей корректировки рН и проводимости перед следующим этапом хроматографии современные системы ДСП включают в себя встроенное разведение и регулировку рН с использованием динамических смесителей. Внутренняя диафильтрация с использованием модулей фильтрации тангенциального потока может непрерывно концентрировать и буферно обменивать продукт, подавая непосредственно в нисходящую полировочную колонку. Эти конфигурации замкнутого цикла уменьшают количество удерживающих сосудов, снижают риск загрязнения и улучшают общий выход, избегая повторных передач насоса и этапов разбавления.

Интегрированные одноразовые решения

Одноразовые технологии стали стандартом в производстве на ранней стадии и в настоящее время переходят на производство биопрепаратов на растительной основе в коммерческих масштабах. Одноразовые фильтры глубины, капсулы мембранной хроматографии и биореакторные мешки для промежуточного хранения позволяют быстро переключаться между продуктами и уменьшать нагрузку на проверку очистки. Интеграция одноразовых модулей в платформу с заносом (например, концепция KUBioTM) позволяет производителям настраивать полный поезд вниз по течению в предварительно проверенной конфигурации с подключаемой и воспроизводимой функцией. Эта гибкость особенно ценна для растительных биопрепаратов, направленных на сценарии реагирования на развивающихся рынках или пандемии, где скорость и масштабируемость имеют решающее значение.

Сосредоточьтесь на устойчивости и зеленой обработке

Растительные биопрепараты уже предлагают более экологичный восходящий поток, устраняя необходимость в компонентах животного происхождения и снижая потребление энергии по сравнению с ферментацией бактерий или млекопитающих. Однако нисходящая обработка традиционно использует большие объемы воды, органических растворителей и высокоэнергетического оборудования. Новые тенденции направлены на минимизацию этого следа.

Снижение потребления воды и буфера

Использование воды в ДСП может быть существенным — несколько тысяч литров на партию для установки среднего масштаба. Системы непрерывной хроматографии снижают расход буфера на 50-70% по сравнению с режимом партии, поскольку колонны загружаются до почти прорывного и элюируются меньшими объемами. Внутренняя концентрация и диафильтрация также минимизируют количество циклов разбавления и реконцентрации. Кроме того, использование смол высокой емкости и адсорберов мембран уменьшает требуемые объемы пласта, непосредственно снижая спрос на воду.

Зеленые растворители и одноразовые модули

В настоящее время предпринимаются усилия по замене традиционных растворителей (например, ацетонитрила для полировки ВЭЖХ) более экологичными альтернативами, такими как этанол, изопропанол или сверхкритический углекислый газ. Для растительных экстрактов в качестве нехроматографических альтернатив для первоначального захвата белков изучаются этапы осаждения на основе этанола или кристаллизации, снижающие потребность в дорогостоящих смолах. Одноразовые модули при производстве пластиковых отходов могут сжигаться для рекуперации энергии и избегать воды, химических веществ и энергии, необходимых для очистки многоразового оборудования. Оценки жизненного цикла показывают, что одноразовые системы часто оказывают более низкое общее воздействие на окружающую среду для производства в клинических масштабах.

Валоризация отходов

Другой тенденцией устойчивости является валоризация растительной биомассы после экстракции. Вместо того, чтобы выбрасывать отработанный растительный материал, компании исследуют восстановление вторичных метаболитов, пищевых волокон или биотоплива из остаточной биомассы. Например, листья N. benthamiana после рекомбинантной экстракции белка могут быть обработаны для извлечения полифенолов с антиоксидантными свойствами, создавая дополнительный поток доходов. Этот круговой подход согласуется с принципами зеленой химии и улучшает общую экономику производства растительных биопрепаратов.

Проблемы и перспективы будущего

Несмотря на значительный прогресс, до достижения биологическими препаратами растительного происхождения паритета с установленными платформами млекопитающих в промышленных масштабах остаются несколько препятствий.Самыми насущными проблемами являются масштабируемость новых методов экстракции и хроматографии, стоимость лигандов сродства на заказ и нормативная стандартизация примесей, характерных для растений.

Масштабируемость новых технологий

В то время как ATPE, мембранная хроматография и непрерывная обработка хорошо работают на скамейке и пилотных масштабах, масштабирование до тысяч килограммов биомассы на партию не всегда просто. Смешивание времен, коэффициенты переноса массы и ограничения падения давления меняются с изменением масштаба, а отсутствие оборудования коммерческого масштаба для некоторых новых технологий (например, мембранные стеки большого формата для прямых вирусных векторов) замедляет принятие. Сотрудничество между поставщиками оборудования и разработчиками биологических растений имеет важное значение для преодоления этого разрыва.

Стоимость таможенных лигандов и СМИ

Для лигандов растительного происхождения разработка и производство в масштабе являются дорогостоящими. Для продуктов ранней фазы стоимость специальной смолы может быть непомерно высокой. Однако по мере увеличения количества растительных биопрепаратов, входящих в испытания фазы III, экономия за счет масштаба приведет к снижению затрат на лиганд. Между тем производители изучают многоразовые аффинные смолы и недорогие альтернативные каркасы, такие как разработанные анкириновые повторные белки (DARPins) в качестве агентов захвата.

Регулятивные соображения

Регулирующие органы, такие как FDA и EMA, все чаще принимают системы на основе растений, что подтверждается одобрением Elelyso® (taliglucerase alfa) из клеток моркови и разрешения на экстренное использование для вакцин против COVID-19 растительного происхождения (санофи / GSK и Medicago). Однако опасения по поводу моделей гликозилирования (особенно наличия растительных гликанов) и потенциала для авантюрных агентов требуют надежных исследований клиренса во время DSP. Тенденция к использованию генно-отредактированных растений с гуманизированными путями гликозилирования (например, гликогенизированные ]N. benthamiana упрощает обработку вниз по течению за счет уменьшения специфических для растений примесей в источнике.