Новые технологии в деле разделения клеток и сортировки для улучшенной биообработки

Введение: Растущее значение клеточного разделения в биообработке

Разделение и сортировка клеток являются фундаментальными операциями в современной биообработке, лежащими в основе производства биофармацевтических препаратов, клеточной терапии, вакцин и диагностических реагентов. По мере того, как индустрия переходит к более сложным биологическим препаратам и персонализированной медицине, спрос на высокочистые, высокожизнеспособные клеточные популяции никогда не был больше. Способность изолировать конкретные типы клеток - будь то выбор клонов, культура перфузии или очистка по потоку - непосредственно влияет на качество продукта, урожайность и стоимость производства. Новые технологии в разделении клеток решают ограничения обычных методов, предлагая бесмаркерные, высокоскоростные и масштабируемые решения, которые легко интегрируются с автоматизированными рабочими процессами биообработки. В этой статье рассматриваются последние достижения в микрофлюидной, акустической и оптической сортировке, их влияние на эффективность биообработки и будущую траекторию поля.

Сортировка клеток — это не просто подготовительный шаг; это часто критический атрибут качества. Например, в терапии CAR-T клеточной чистотой исходная популяция Т-клеток определяет терапевтическую эффективность и безопасность. В производстве моноклональных антител высокожизнеспособные культуры семян приводят к последовательной производительности кормовой партии. В производстве вакцин надежная сортировка клеток обеспечивает высокие выходы вирусных векторов или антигенов. Поскольку нормативные рамки подчеркивают качество по дизайну, необходимость точных, воспроизводимых и мягких методов разделения клеток стала первостепенной. Новые технологии, описанные ниже, представляют собой сдвиг парадигмы от массовых, основанных на партиях методов к непрерывной сортировке с высоким разрешением, которая сохраняет функциональность клеток при максимизации пропускной способности.

Традиционные методы разделения клеток и их ограничения

В течение десятилетий биопроцессоры полагались на несколько установленных методов для разделения клеток. Пока эти методы остаются в использовании, их неотъемлемые компромиссы между скоростью, чистотой и жизнеспособностью мотивировали поиск альтернатив. Понимание этих ограничений обеспечивает контекст для инноваций, обсуждаемых позже.

Центрифугирование и фильтрация

Центрифугирование градиента плотности является одним из старейших и наиболее широко используемых методов разделения клеток. Оно опирается на различия в плотности клеток для создания различных полос после вращения. Хотя простое и недорогое центрифугирование по своей сути ориентировано на партии, требует больших объемов разделительных сред и может подвергать клетки воздействию высоких сдвиговых сил, которые снижают жизнеспособность. Фильтрация, используя мембраны или фильтры глубины, разделяет клетки на основе размера, но страдает от засорения, ограниченного разрешения и невозможности различать клетки аналогичного размера, но разных фенотипов. Оба метода плохо подходят для непрерывной обработки и не имеют точности, необходимой для редкой изоляции клеток.

Магнитно-активированная клеточная сортировка

Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) использует магнитные бусины с покрытием антител для маркировки клеток-мишеней, которые затем удерживаются в магнитном поле, в то время как немаркированные клетки проходят через. MACS широко принята за его простоту и способность обрабатывать большие числа клеток. Однако технология требует маркировки, которая может активировать или изменять рецепторы клеточной поверхности, потенциально компрометируя приложения ниже по течению. Кроме того, магнитные бусины должны быть удалены после сортировки, добавив дополнительный шаг и потенциал для потери клеток. MACS также ограничена пропускной способностью, когда требуется высокая чистота, часто требующая нескольких проходов.

Флуоресцентно-активированная клеточная сортировка (FACS)

FACS — часто считается золотым стандартом — использует лазерный опрос флуоресцентно меченных ячеек и отклонение на основе капель для достижения точности одиночных ячеек. В то время как FACS предлагает беспрецедентную чистоту и многопараметрический анализ, он медленный для промышленных масштабов, дорогой в эксплуатации и может вызвать значительный стресс из-за высокого давления и лазерного воздействия. Сложность приборов и необходимость в обученных операторах еще больше ограничивают его развертывание в производственных средах. Недавние достижения в FACS улучшили скорость и уменьшили сдвиг, но технология остается ограниченной стоимостью и масштабируемостью.

В совокупности эти традиционные методы демонстрируют по меньшей мере один из следующих недостатков: зависимость от этикеток, работа с партиями, низкая пропускная способность, высокий сдвиг или плохая масштабируемость. Новые технологии стремятся преодолеть эти проблемы с помощью принципиально разных физических принципов.

Новые технологии: без этикеток, высокоскоростные и масштабируемые

Последние инновации в сортировке клеток используют микромасштабную физику, акустику и оптику для достижения разделения без меток, сохраняя при этом высокую пропускную способность и бережное обращение. Эти методы по своей сути более поддаются интеграции в непрерывные поезда биообработки и предлагают новые возможности для мониторинга и автоматизации в реальном времени.

Сортировка микрофлюидных клеток

Микрожидкостная технология манипулирует небольшими объемами жидкости в каналах с размерами, сравнимыми с человеческим волосом.Используя физические свойства, такие как размер, форма, деформируемость и электрическое сопротивление, микрожидкостные устройства могут отделять клетки с высоким разрешением и минимальным механическим напряжением.

Инерциальная фокусировка и детерминированное боковое смещение — два пассивных микрофлюидных метода, которые полагаются на геометрию канала и динамику жидкости. Инерциальная фокусировка использует баланс сил подъема и сопротивления для выравнивания клеток вдоль конкретных обтекателей, что позволяет разделение на основе размера при высоких скоростях потока. В детерминистических массивах бокового смещения (DLD) используются точно расположенные микропосты, которые отклоняют клетки больше критического размера, достигая резких отсечек. Оба метода являются безмаркерными, непрерывными и способными обрабатывать миллионы клеток в минуту. Они были успешно продемонстрированы для фракционирования клеток крови, изоляции циркулирующих опухолевых клеток и разделения бактерий.

Диелектофорез (DEP) является активным микрофлюидным методом, который использует неоднородные электрические поля для поляризации клеток и перемещения их в области с высоким или низким градиентом поля. DEP может дифференцировать клетки на основе мембранной емкости, цитоплазматической проводимости и размера — все без меток. Современные сортировщики DEP работают в непрерывном потоке и могут достигать скорости сортировки, приближающейся к FACS. Ключевое преимущество заключается в том, что DEP является щадящим и обратимым, сохраняя жизнеспособность клеток. Недавние работы интегрировали DEP с машинным обучением для классификации в режиме реального времени, позволяя сортировать решения на основе внутренних биофизических сигнатур.

Сортировка на основе импеданса объединяет микрофлюидные каналы с микроэлектродами для измерения электрической сигнатуры каждой клетки при прохождении через зону обнаружения. Различия в размере клетки, целостности мембраны и содержании органелл производят различные профили импеданса. Этот метод является безмаркерным, высокоскоростным и легко миниатюризированным. Сортировка клеток с импедансной активностью (IACS) была продемонстрирована для отбора клеток яичников китайского хомяка (CHO) на основе жизнеспособности и производительности, непосредственно относящейся к биообработке.

Микрофлюидные системы по своей сути масштабируются посредством параллелизации - конструкции с сотнями сортирующих каналов, работающих одновременно, могут достигать промышленной пропускной способности. Их небольшой охват и совместимость с жидкостями с замкнутой системой делают их привлекательными для надлежащей производственной практики (GMP) среды.

Акустическая клеточная сортировка

Акустическая сортировка использует стоячие звуковые волны для воздействия на клетки сил излучения, перемещая их в узловые или антинодальные положения в пределах акустического поля.Масштабы силы зависят от размера ячейки, плотности и сжимаемости, обеспечивая безметочный механизм разделения. Акустическая сортировка бесконтактна, непрерывна и работает при умеренных скоростях потока с минимальным сдвигом.

Акустофорез — наиболее зрелый акустический метод. В типичном устройстве пьезоэлектрический преобразователь генерирует ультразвуковые волны, которые распространяются в микроканал. Клетки испытывают боковую силу, которая вытесняет их к узлу давления стоячей волны. При регулировании частоты и мощности различные клеточные популяции могут быть сфокусированы или разделены на отдельные выходы. Акустофорез используется для выделения жизнеспособных из нежизнеспособных клеток, обогащения циркулирующих опухолевых клеток из крови и фракционирования мононуклеарных клеток периферической крови.

Одним из существенных преимуществ акустической сортировки является ее мягкость: клетки испытывают незначительный сдвиговой стресс, а исследования показали, что сортированные клетки сохраняют высокую жизнеспособность и полную функциональность. Технология также легко интегрируется с выходами биореактора вверх по течению, что позволяет непрерывное уточнение и удержание клеток. Для перфузионных культур устройства удержания акустических клеток могут поддерживать высокую плотность клеток при удалении мертвых клеток, тем самым повышая объемную производительность при производстве моноклональных антител.

Недавние достижения включают разработку многоступенчатых акустических сортировщиков, которые могут одновременно разделять несколько популяций клеток, и гибридных акустическо-микрофлюидных чипов, которые сочетают предварительную концентрацию, стирку и сортировку в одном устройстве со скоростью потока, превышающей 100 мл / ч. Акустическая сортировка также изучается для выделения экзосом и везикул, расширяя ее полезность для биообработки без клеток.

Оптическая и лазерная сортировка

Однако наиболее захватывающие разработки заключаются в безмаркированных оптических методах, которые используют внутренние свойства клеток, такие как автофлюоресценция, рамановское рассеяние или морфология, вместо того, чтобы требовать внешних меток.

Варианты без маркировки FACS используют детекторы, калиброванные для измерения эндогенной флуоресценции (например, NADH, флавины) или световых рассеяний, которые коррелируют с состоянием клеток. Например, клетки CHO, экспрессирующие рекомбинантные белки, часто имеют разные сигнатуры автофлюоресценции из-за метаболических изменений. Обучая классификаторы машинного обучения на этих сигнатурах, исследователи добились сортировки решений без каких-либо добавленных красителей или антител. Этот подход устраняет стоимость и потенциальную токсичность меток и позволяет сортировать клетки, которые не могут переносить маркировки.

Сортировка клеток, активированных раманом (RACS) , использует рамановскую спектроскопию для получения химического отпечатка каждой клетки. Рамановские спектры предоставляют информацию о белках, липидах, нуклеиновых кислотах и углеводах — по сути, метаболический снимок. Хотя внутренний сигнал рамана слаб, недавние достижения в поверхностном рамановом рассеянии (SERS) и когерентном анти-стоксовом рамановом рассеянии (CARS) улучшили скорость получения. системы RACS теперь работают со скоростью, приближающейся к 100 клеткам в секунду, и используются для сортировки липид-продуцирующих микроводорослей, идентификации бактериальных штаммов и выбора высокобелковых клеток CHO. Хотя они все еще медленнее, чем FACS, RACS предлагает беспрецедентную биохимическую специфичность без меток.

Сортировка на основе яркого поля и фазово-контрастных изображений использует те же высокоскоростные камеры и компьютерное зрение, что и автономные транспортные средства. Модели глубокого обучения могут быть обучены распознавать морфологические особенности, такие как размер клеток, гранулярность и присутствие вакуолы, которые коррелируют с желаемыми чертами (например, плюрипотентность стволовых клеток, инвазивность раковых клеток). Сортировка клеток с активированным изображением (IACS) сочетает в себе микрофлюидный сортировщик с анализом изображений в реальном времени и механизмом быстрого переключения. Этот подход является безмаркерным, неинвазивным и может применяться к адептским клеткам, собранным из микроносителей. IACS становится мощным инструментом для выбора клонов в развитии клеточной линии, где тысячи отдельных клеток должны быть оценены для роста и производительности.

Оптические методы, будь то меченные или без этикеток, выигрывают от постоянного улучшения чувствительности детектора, лазерной стабильности и вычислительной скорости.По мере того, как алгоритмы искусственного интеллекта становятся более надежными, границы того, что можно вывести из простого изображения с ярким полем, будут продолжать расширяться.

Влияние на биопроцессинг: пропускная способность, чистота и интеграция процессов

Принятие новых технологий разделения клеток уже меняет биообработку в нескольких областях. Увеличение пропускной способности - от тысяч до миллионов клеток в секунду - позволяет напрямую сортировать урожай биореактора без промежуточных этапов расширения. Более высокая чистота снижает нагрузку на хроматографию ниже по течению и минимизирует примеси, связанные с продуктом. И поскольку многие из этих методов являются мягкими, они поддерживают высокую жизнеспособность, что имеет решающее значение для производства клеточной терапии, где каждая клетка имеет значение.

В клеточной терапии.] CAR-T и другие приемные клеточные терапии требуют выделения из материала афереза пациента специфических подмножеств Т-клеток (например, CD4+, CD8+, центральная память). Традиционные FACS являются клиническими, но медленными и дорогостоящими. Акустические и микрофлюидные сортировщики развертываются для обработки всего мешка лейкафереза менее чем за час, с >95% жизнеспособностью и незначительной активацией. Это не только снижает стоимость, но и сокращает время вены-к-вене. Несколько компаний теперь предлагают GMP-совместимые акустические сортировщики для производства клеточной терапии.

При производстве моноклональных антител. Развитие клеточной линии CHO опирается на моноклональность и высокую производительность одноклеточного клонирования. Традиционное ограничивающее разведение неэффективно и отнимает много времени. Микрофлюидные и сортировщики на основе изображений могут депонировать одиночные клетки на 384-луночные пластины за считанные минуты, с визуальным подтверждением моноклональности. Это ускоряет отбор клонов от месяцев до недель. Кроме того, непрерывное удержание клеток с помощью акустических фильтров в перфузионных культурах увеличивает объемную производительность на 3-5 × по сравнению со стандартными пакетными процессами.

В производстве вакцин и вирусных векторов. Сортировка клеток-производителей (например, HEK293, Sf9) на основе вирусного выхода или инфекционного статуса является новым применением. Сортировка без этикеток Raman может идентифицировать клетки с высоким производством вируса на основе их метаболических отпечатков пальцев, что позволяет обогащать высокодоходные субпопуляции до сбора урожая. Этот подход был продемонстрирован для производства лентивирусных векторов, улучшая титры более чем в 10 раз. Аналогично, акустическая сортировка может удалять мертвые клетки из биореактора, не нарушая культуру, продлевая продолжительность процесса и увеличивая общий выход вируса.

В диагностике и персонализированной медицине. Технологии сортировки новых клеток позволяют проводить жидкую биопсию на основе циркулирующих опухолевых клеток (ЦТК) или клеток плода. Микрофлюидные и акустические методы могут изолировать редкие клетки из цельной крови при высокой чистоте, облегчая раннее обнаружение рака и мониторинг реакции на лечение. Те же платформы адаптируются для применения в точках ухода, выводя отделение клеток из централизованных лабораторий и в клиники.

Будущие перспективы: ИИ, автоматизация и устойчивость

Траектория технологии разделения клеток указывает на полностью интегрированную, интеллектуальную и экологически устойчивую биообработку. Три основные тенденции формируют будущее.

Искусственный интеллект и интеграция машинного обучения

ИИ уже позволяет сортировать без меток, извлекая тонкие особенности из изображений, профилей импеданса или спектров, которые люди не могут воспринимать. В ближайшем будущем контроллеры ИИ с замкнутым контуром будут корректировать параметры сортировки в режиме реального времени на основе обратной связи от аналитики нисходящего потока, оптимизируя выход и чистоту на лету. Алгоритмы обучения с подкреплением будут учиться максимизировать производительность процесса с течением времени, адаптируясь к изменчивости пакетов в исходном материале клеток. ИИ также будет способствовать слиянию многоомических данных - комбинируя сортировку клеток с секвенированием РНК одной клетки, протеомикой или метаболомикой - для выявления лучших кандидатов клеток для биообработки или терапии.

Автоматизация и непрерывная обработка

По мере того, как биообработка движется к полностью непрерывному производству, технологии разделения ячеек должны быть совместимы с операциями в верхнем и нижнем течении. Новые сортировщики разрабатываются как модульные одноразовые кассеты, которые могут быть интегрированы в непрерывный поезд, от биореактора до очистки. Уже появляются платформы автоматизации, которые сочетают сортировку, стирку и сокращение объема в единый рабочий процесс. Это уменьшает труд, исключает открытую обработку и улучшает управление процессом. Видение «цифрового двойника биопроцесса» Индустрии 4.0 будет полагаться на датчики и исполнительные механизмы, встроенные в эти сортировщики ячеек, чтобы предоставлять данные процесса в режиме реального времени.

Устойчивость и снижение затрат

Методы без этикеток устраняют экологическое и экономическое бремя производства, доставки и утилизации антител, красителей или магнитных бусин. Они также используют меньше энергии и воды, чем традиционные центрифугирования или FACS. Непрерывные акустические или микрофлюидные сортировщики могут работать в течение нескольких дней без вмешательства, уменьшая расходные отходы. По мере того, как глобальные масштабы биопроизводства для удовлетворения спроса на клеточную и генную терапию, принятие этих более чистых технологий снизит углеродный след на дозу. Более того, высокие выходы и снижение частоты отказов, обеспечиваемых точной сортировкой, непосредственно улучшают устойчивость всей производственной цепочки.

Заключение. Новые технологии разделения клеток — микрофлюидные, акустические и оптические — больше не являются лабораторными любопытствами; они становятся важными инструментами в коммерческой биообработке. Предлагая безмаркерную, щадящую, высокоскоростную и масштабируемую сортировку, они обращаются к критическим болям традиционных методов и открывают новые возможности для производства по дизайну. По мере того, как ИИ и автоматизация становятся все более зрелыми, сортировщик клеток завтрашнего дня будет интеллектуальным, самооптимизирующим компонентом полностью интегрированного непрерывного процесса. Результатом будут более качественные биофармацевтические препараты, более быстрые сроки разработки и более доступные методы лечения для пациентов во всем мире.

Дальнейшее чтение: Для всестороннего обзора сортировки микрожидких клеток см. «Сортировка микрожидких клеток для биообработки» в Достижения биотехнологии . Достижения в акустической сортировке суммируются в «Акустическое разделение биологических частиц» в Материалы обзоров природы . Применение машинного обучения для сортировки клеток с активацией изображения описано в «Сортировка клеток с поддержкой глубокого обучения» в Природный машинный интеллект .