Table of Contents

Введение: проблема кислорода в культуре МСК

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обладают замечательным терапевтическим потенциалом для регенеративной медицины, иммуномодуляции и тканевой инженерии. Их способность самостоятельно обновляться и дифференцироваться в остеобласты, хондроциты и адипоциты делает их краеугольным камнем клеточной терапии. Однако крупномасштабное расширение МСК при сохранении их функциональных свойств остается значительным препятствием. Среди многих параметров культуры — состава среды, факторов роста, жесткости субстрата и количества проходов — кислородное напряжение выделяется как особенно влиятельный, но часто упускаемый из виду фактор. Стандартная практика культивирования МСК под окружающим воздухом (приблизительно 21% кислорода) мало похожа на низкокислородную микросреду их родных ниш. Это несоответствие может привести к субоптимальной пролиферации, преждевременному старению и потере мультипотентности.

За последнее десятилетие все больше доказательств показало, что корректировка напряжения кислорода на физиологически релевантные уровни - обычно 1-5% - может значительно повысить эффективность расширения МСК и терапевтическое качество. Понимание основных механизмов и практическое внедрение контроля кислорода имеет важное значение для исследователей и клиницистов, стремящихся производить высококачественные МСК в масштабе. Эта статья предоставляет всеобъемлющий обзор роли кислородного напряжения в культуре МСК, вовлеченных молекулярных путей и действенных рекомендаций для оптимизации протоколов расширения.

Физиологическое напряжение кислорода: родная ниша MSC

В естественных условиях МСК находятся в перисосудистых нишах в костном мозге, жировой ткани и других органах. Эти среды характеризуются кислородными напряжениями в диапазоне от 1% до 8%, намного ниже атмосферных уровней. Например, напряжение кислорода костного мозга оценивается от 1% до 7%, в зависимости от конкретного местоположения и васкуляризации. В жировой ткани наблюдается аналогичный низкий уровень кислорода, особенно в более глубоких областях. Эта гипоксическая среда не случайна; она активно регулирует поддержание стволовых клеток, умиротворение и метаболическое программирование.

Почему кислород в атмосфере вызывает стресс у МСК

При 21% кислорода МСК подвергаются воздействию гипероксичных условий относительно их естественной среды обитания. Такие высокие уровни кислорода увеличивают производство активных форм кислорода (ROS) в митохондриях. Повышенный ROS может повредить клеточные компоненты - белки, липиды и ДНК - и активировать сигнальные пути стресса. Со временем это приводит к репликативному старению, снижению пролиферативной способности и сдвигу в сторону остеогенной или адипогенной дифференциации, часто за счет стволовости. Исследования показали, что МСК, культивируемые под 21% кислорода, накапливают больше повреждений ДНК и демонстрируют укороченные теломеры по сравнению с теми, которые выращиваются при 2-5% кислорода.

Гипоксия как физиологический сигнал

Легкая гипоксия (1–5% кислорода) — это не стрессовое состояние, а скорее физиологический сигнал, который запускает адаптивные реакции. Центральным медиатором является фактор, индуцируемый гипоксией (HIF). При нормоксии HIF-1α гидроксилируется ферментами пролилгидроксилазного домена (PHD) и деградирует через путь фон Хиппель-Линдау (VHL). При низком кислороде активность PHD ингибируется, позволяя HIF-1α накапливаться, транслоцироваться в ядро и образовывать гетеродимер с HIF-1β. Этот комплекс транскрипции активирует сотни генов-мишеней, участвующих в метаболизме, ангиогенезе, выживании клеток и стволовости.

Ключевые цели HIF, относящиеся к МСК, включают:

  • Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF): Способствует ангиогенезу и поддерживает выживаемость МСК в ишемической среде.
  • Глюкозный транспортер 1 (GLUT1) и лактатдегидрогеназа A (LDHA): Переход метаболизма от окислительного фосфорилирования к гликолизу, снижение выработки ROS.
  • CXCR4: Усиляет миграцию МСК и самонаведение в поврежденные ткани.
  • Oct4, Sox2 и Nanog: Поддерживают плюрипотентность и маркеры стволовых клеток.

Таким образом, оптимизация кислородного напряжения, по существу, воссоздает сигнальную среду, которая удерживает МСК в регенеративном, пролиферативном состоянии.

Влияние кислородной напряженности на пролиферацию МСК

Многочисленные исследования сообщили о повышении скорости пролиферации, когда МСК культивируются при гипоксии (1–5% О2) по сравнению с нормоксией (21% О2). Эффект обычно наблюдается после нескольких дней адаптации и может привести к 1,5-3-кратному увеличению числа клеток за тот же период культуры. Важно отметить, что усиленная пролиферация не сопровождается потерей дифференцирующей способности или повышенным опухолевым риском. Механизм включает снижение уровней ROS, активацию путей PI3K/Akt и ERK и повышенную экспрессию циклинов, таких как циклин D1.

Оптимальные уровни кислорода для пролиферации

Хотя 1-5% кислорода в целом является полезным, точный оптимальный уровень может зависеть от источника ткани и возраста донора. Для МСК костного мозга (BM-MSCs) 2-5% кислорода, по-видимому, дают максимальную пролиферацию. Для МСК жирового происхождения (AD-MSCs) часто предпочитают 1-3%. МСК пуповинной крови могут лучше реагировать на немного более высокий кислород - около 5%. Исследователи должны выполнить предварительные эксперименты с дозой-ответом для их конкретного типа клеток.

Длительность и пассивные эффекты

Преимущества гипоксии наиболее выражены во время ранних переходов (P0-P5). Расширенная культура за пределами P10 при гипоксии все еще может быть полезной, но клетки могут постепенно адаптироваться и проявлять уменьшенный ответ. Кроме того, переход от гипоксии к нормоксии (например, во время сбора урожая) может вызвать всплеск ROS; постепенный протокол реоксигенации (восстановление кислорода в течение 2-4 часов) помогает смягчить этот шок.

Сохранение стеблести и дифференцированный потенциал

Одной из основных проблем с крупномасштабным расширением MSC является потеря мультипотентности — то, что часто называют «реплицативным старением» или «культурным шоком». Гипоксия помогает поддерживать более молодой фенотип. MSC, выращенные под низким содержанием кислорода, демонстрируют более высокую экспрессию SSEA-4, CD73, CD90 и CD105 (положительные маркеры MSC) и более низкую экспрессию CD34 и CD45. Они также сохраняют превосходную способность дифференцироваться в кости, хрящи и жир после воздействия гипоксии.

Интересно, что гипоксия влияет на родословную. При некоторых условиях гипоксия может способствовать хондрогенезу и адипогенезу при подавлении остеогенеза. Однако в сочетании с соответствующими индукционными факторами гипоксическое предварительное обусловливание может фактически усилить остеогенную дифференциацию, усиливая Runx2 и Osterix. Контекст и время имеют большое значение.

Механизмы поддержания стеблевой стойкости

  • HIF-2α сигнализация: В то время как HIF-1α больше связан с метаболической адаптацией, HIF-2α непосредственно активирует Oct4 и Sox2 для поддержания стволовости.
  • Гистоновые модификации: Гипоксия изменяет структуру хроматина через гистондеметилазы (например, JMJD1A, JMJD2B), сохраняя гены стволовых клеток доступными.
  • Метаболическое ремоделирование: Гликолизис производит меньше ROS, который защищает геном и сохраняет активность теломеразы.

Практические подходы к контролю кислородного напряжения

Для реализации гипоксической культуры в лабораторных или производственных условиях существует несколько вариантов оборудования, каждый из которых имеет компромиссы в стоимости, точности и масштабируемости.

Гипоксические инкубаторы

Выделенные гипоксические инкубаторы (например, от таких компаний, как Baker, Thermo Fisher или Panasonic) вводят азот или смесь азот/CO2 для вытеснения кислорода. Они могут поддерживать стабильные уровни кислорода от 0,1% до 20% с высокой точностью (±0,1% O2). Они идеально подходят для небольших исследований, но могут быть дорогими и могут потребовать частой калибровки и управления газовыми баллонами.

Газонепроницаемые камеры и модульные инкубаторные камеры

Для лабораторий с ограниченным бюджетом модульные камеры (например, Billups-Rothenberg) могут быть помещены внутрь стандартного инкубатора CO2. Камера промывается предварительно смешанным газом (например, 5% O2, 5% CO2, баланс N2) и запечатана. Такой подход проще, но менее стабилен; уровни кислорода могут дрейфовать, когда камера открыта для изменений среды или отбора проб. Он подходит для краткосрочных экспериментов, но не для крупномасштабного производства.

Биореакторы с контролем кислорода

Для расширения в клинических масштабах (миллиарды клеток) биореакторы, такие как Quantum® (Terumo BCT) или биореакторы с вертикальными колесами (PBS Biotech), обеспечивают интегрированное управление кислородом посредством аэрации головного пространства или прямого спаринга. Эти системы измеряют растворенный кислород (dO2) в реальном времени с использованием оптических датчиков и соответствующим образом корректируют газовую смесь. Биореакторы также позволяют перфузии, которая поддерживает согласованные уровни кислорода во всей культуре даже при увеличении плотности клеток.

Протокольные соображения по поводу гипоксической культуры МСК

Успех при гипоксии требует тщательного внимания к деталям. Следующие рекомендации могут помочь обеспечить воспроизводимость и оптимальные результаты.

Акклиматизация и адаптация

МКС, подвергшиеся внезапному падению с 21 до 1 % кислорода, могут подвергаться переходному стрессу. Постепенное снижение (например, постепенное снижение в течение 24-48 часов) может улучшить адаптацию. Альтернативно, клетки могут быть расширены при нормоксии для первого прохода, а затем перенесены в гипоксию для последующих проходов. Это предотвращает шоковую реакцию, которая может убить часть культуры.

СМИ и добавки

Гипоксический метаболизм в значительной степени зависит от гликолиза. Средства должны содержать адекватную глюкозу (1-4,5 г/л) и быть буферизованными для увеличения производства лактата. Некоторые исследователи дополняют антиоксидантами, такими как витамин С или N-ацетилцистеин, для дальнейшего снижения окислительного стресса, но они могут мешать передаче сигналов гипоксии и должны использоваться с осторожностью. Сыворотка крупного рогатого скота (FBS) также может влиять на ответ, потому что сыворотка содержит различное количество факторов роста и гормонов; без сыворотки или без ксенона препараты предпочтительны для клинического применения.

Контроль кислорода

Простое размещение инкубатора на уровне 5% O2 не гарантирует, что клетки будут испытывать этот уровень. Кислородные датчики, размещенные внутри сосуда для культивирования или на входе в газ, точно измеряют то, что видят клетки. Предварительное нагревание газовой смеси и среды помогает предотвратить колебания при открытии двери инкубатора. Для долгосрочных культур рассмотрите возможность использования регистратора данных для отслеживания уровня кислорода.

Вызовы и подводные камни

Несмотря на свои преимущества, гипоксическая культура не лишена проблем. Могут развиваться градиенты кислорода внутри сосуда культуры, особенно в статической культуре. При высоком слиянии клеток скорость потребления кислорода может превышать скорость диффузии, создавая микроокружения тяжелой гипоксии (около 0%) на дне колодца или колбы. Это может привести к гибели клеток или нежелательной дифференцировке. Перемешивание или перфузия могут смягчить это.

Другой проблемой является переменная реакция МСК от разных доноров. Возраст донора, состояние здоровья и источник ткани влияют на оптимальный уровень кислорода. Персонализированная оптимизация может быть необходима для аллогенной терапии.

Наконец, регулирующие органы часто требуют четко определенных условий культуры для продуктов клеточной терапии. Гипоксия должна быть документирована как критический параметр процесса, с проверенными датчиками кислорода и сигнализацией. Использование компонентов животного происхождения наряду с гипоксией может затруднить одобрение.

Тематические исследования и исследовательские высочайшие

Несколько групп успешно перевели гипоксическое расширение МСК в производство в клинических масштабах. Например, исследование 2020 года, проведенное Czapla et al. , показало, что МСК, расширенные под 2% кислорода в биореакторе вертикального колеса, сохранили более высокую иммуносупрессивную функцию и произвели на 50% больше внеклеточных пузырьков, чем клетки, выращенные при 21% кислорода. Аналогичным образом, Bader et al. (2021) показали, что гипоксическое предварительное кондиционирование улучшило выживаемость МСК и приживление в модели инфаркта миокарда крысы.

Другой примечательный случай: GMP-совместимый производственный процесс для МСК, полученных из костного мозга, использовал 5% кислорода для первых трех проходов, а затем переключился на нормоксию для заключительного этапа расширения. Этот гибридный подход уравновешивал преимущества гипоксии с легкостью нормоксичной терминальной культуры, обеспечивая клетки с высокой эффективностью для клинического исследования фазы I при болезни трансплантата против хозяина.

Будущие направления: интеллектуальный контроль кислорода и обратная связь в реальном времени

Следующее поколение платформ расширения MSC, вероятно, будет включать в себя мониторинг кислорода в реальном времени и адаптивное управление. Оптические датчики, встроенные в культурологическое программное обеспечение, могут передавать данные dO2 в петлю обратной связи, которая регулирует поток газа. Алгоритмы машинного обучения могут прогнозировать оптимальные профили кислорода на основе плотности клеток, метаболической активности и желаемого фенотипического результата.

Кроме того, сочетание гипоксии с другими микроэкологическими сигналами, такими как перфузионный сдвигающий стресс, жесткость субстрата и 3D-каркасы, может создать целостную «нишу на чипе», которая максимизирует расширение MSC при сохранении потенции. Исследования уже изучают, как прерывистая гипоксия (циклы низкого и нормального кислорода) влияет на экспрессию генов MSC по сравнению с непрерывной гипоксией.

Наконец, роль кислородного напряжения в криоконсервации и восстановлении после оттепели является новой областью. Предварительное замораживание гипоксической культуры может улучшить жизнеспособность и функцию клеток после оттаивания, что имеет решающее значение для готовой клеточной терапии.

Вывод: сделать кислородное напряжение стандартным параметром

Оптимизация кислородного напряжения не роскошь, а необходимость для любого, кто серьезно относится к мезенхимальному расширению стволовых клеток. Выравнивая условия культуры с естественной микросредой, исследователи могут достичь более высоких урожаев, лучшей стволовости и улучшенных терапевтических результатов. Хотя первоначальные инвестиции в гипоксическое оборудование и валидацию могут быть значительными, возврат - с точки зрения качества клеток и воспроизводимости - это того стоит. По мере того, как область движется к крупномасштабному производству и утверждению регулирующих органов, контроль кислородного напряжения станет стандартной частью каждого протокола расширения MSC.

Мы настоятельно рекомендуем каждой лаборатории, в настоящее время использующей 21% кислорода для культуры МСК, пересмотреть эту практику. Начните с простого пилотного эксперимента: сравните пролиферацию и дифференцировку с 5% и 21% кислорода в течение двух пассажей. Результаты могут привести к постоянному сдвигу в вашем протоколе. Для дальнейшего чтения обратитесь к таким ресурсам, как руководство Международного общества исследований стволовых клеток или всеобъемлющий обзор Ejtehadifar et al. (2020) о влиянии кислорода на стволовые клетки.