Повышение эффективности восстановления белка с помощью новых технологий разделения

Фракционирование потока полей (FFF) объединяет микрофлюидики с внешним полем (например, тепловым, электрическим или центробежным) для разделения аналитов на основе их коэффициентов диффузии или заряда. Асимметричный поток FFF особенно эффективен для характеристики белковых агрегатов, что имеет решающее значение для контроля качества в биофармацевтическом производстве.

Микрофлюидики на основе капель обеспечивают раздельно-отдельную среду для анализа одного белка и анализа связывания. Хотя пока еще не является крупномасштабным методом восстановления, он ускоряет разработку процесса путем скрининга сотен условий одновременно с минимальным потреблением проб.

Техника, основанная на аффинити

Разделение аффинности зависит от специфического, обратимого взаимодействия между целевым белком и связывающим лигандом. Новые технологии лиганда значительно расширили набор инструментов для захвата белка.

Магнитные бусины аффинности, покрытые антителами, аптамерами или синтетическими красителями, позволяют быстро, мягко захватывать белки-мишени из сырых лизатов. После связывания бусины легко отделяются с помощью магнитного поля, устраняя необходимость центрифугирования или упаковки колонн. Этот метод особенно полезен для очистки лабильных белков, которые разрушаются во время обычной обработки. Достижения в производстве бусин производят сверхпарамагнитные частицы с однородным размером и высокой магнитной восприимчивостью, что позволяет эффективно восстанавливаться даже из вязких потоков корма.

Синтетические лиганды аффинности, такие как пептиды, аптамеры и молекулярно импринтированные полимеры (MIP), предлагают более низкие затраты на производство и большую стабильность, чем биологические лиганды, такие как белок А. Например, было показано, что новые пептидные лиганды, предназначенные для захвата моноклональных антител, достигают сопоставимой чистоты с хроматографией белка А, сопротивляясь деградации в условиях едкой очистки. Аналогично, функционирующие аптамером мембраны могут избирательно связывать конкретные белковые мишени с высоким сродством, открывая дверь для полностью синтетической переработки ниже по течению.

Методы сепарации, улучшающие поверхность , такие как плазмонное нагревание или электрохимическое элюирование, дополнительно повышают эффективность захвата аффинности, обеспечивая быстрые, мягкие условия элюирования, которые сохраняют структуру и активность белка.

Гибридные и интегрированные системы

Возможно, наиболее интересной тенденцией является сочетание нескольких новых технологий в единые интегрированные платформы. Например, адсорбция мембран и электрокинетическая фокусировка могут быть объединены в «электромембранном» устройстве, которое одновременно концентрирует и очищает белки. Аналогично, микрофлюидные устройства могут включать зоны захвата аффинности и фракционирование полевого потока для многомерных разделений в непрерывном потоке.

Непрерывная обработка по нисходящей линии, где улавливание, промежуточная очистка и полировка связаны в одном поезде, чрезвычайно выигрывает от таких гибридных систем. Принятие непрерывного производства в биофармацевтической промышленности стимулирует спрос на компактные модульные разделительные блоки, которые могут работать круглосуточно с минимальным вмешательством человека. Интегрированные системы, которые сочетают ультрафильтрацию с аффинной хроматографией (например, адсорберы мембран белка A) уже были продемонстрированы в коммерческом масштабе производства mAb, достигая урожайности выше 95% при сокращении потребления буфера более чем на 70% по сравнению с пакетными процессами.

Интенсификация процессов и масштабирование

Перевод новых технологий разделения из лаборатории в промышленную биообработку требует тщательного внимания к интенсификации процесса.Ключевые факторы включают линейную масштабируемость, воспроизводимость и интеграцию с операциями по восходящей и нисходящей части.

Для мембранных систем масштабирование часто достигается за счет увеличения площади мембраны (например, стековых модулей или использования полых картриджей). Однако поддержание равномерного распределения потока и минимизация поляризации концентрации в больших масштабах остается проблемой. Моделирование вычислительной динамики текучей среды (CFD) все чаще используется для оптимизации конструкции модуля и прогнозирования производительности в разных масштабах.

Микрофлюидные устройства сталкиваются с трудностями в пропускной способности — большинство лабораторных устройств работают при микролитрах в минуту. Для решения этой проблемы исследователи разработали стратегии параллелизации, такие как нумерация сотен микроканалов в плоском массиве. Компании в настоящее время коммерциализируют «миллифлюидные» системы, которые преодолевают разрыв между микромасштабными и производственными скоростями потока, что позволяет непрерывно обрабатывать литры в час.

Электрокинетические методы должны бороться с нагреванием Джоуля и градиентами pH, которые могут скомпрометировать разделение при высоких прочностях поля. Достижения в технологиях охлаждения, таких как интегрированные радиаторы или системы с замкнутым контуром охлаждающей жидкости, позволили масштабировать приложения электрического поля для обработки объемов нескольких литров.

Для магнитного разделения на основе аффинности требуются высокоградиентные магнитные сепараторы (HGMS), способные захватывать шарики из проточной суспензии. В настоящее время доступны блоки HGMS с большими рабочими объемами (до 50 л), позволяющие осуществлять пакетную или полунепрерывную обработку для промышленных применений. Ключ заключается в балансировании напряженности магнитного поля, скорости потока и времени пребывания для максимизации эффективности захвата без превышения пропускной способности шариков.

Устойчивость и экономическое воздействие

Новые технологии разделения предлагают значительные экологические и экономические преимущества по сравнению с традиционными методами. Снижение потребления буфера и реагента напрямую приводит к снижению затрат на сырье и уменьшению образования сточных вод. Например, мембранные адсорберы могут сократить использование буфера на 50-80% по сравнению с колоннами хроматографии на основе смолы, а также устранить необходимость упаковки колонн, проверки очистки и хранения отработанной смолы.

Энергопотребление является еще одним критическим фактором. Мембранные и микрофлюидные процессы работают при низких давлениях (0,5-2 бар), тогда как традиционная упакованная хроматография требует давления 3-10 бар. Более низкая потребность в энергии снижает углеродный след и эксплуатационные расходы. При непрерывной обработке общая производительность (граммы очищенного белка на литр объема оборудования в час) может быть в 5-10 раз выше, чем пакетные процессы, что означает меньшие мощности и меньшие капитальные вложения.

Исследования оценки жизненного цикла, сравнивающие хроматографию белка А с захватом мембран аффинности для моноклональных антител, показали, что мембранный путь снижает потенциал глобального потепления на 40% и потребление воды на 60%.Поскольку регулирующие органы и потребители все чаще требуют устойчивого производства, внедрение этих технологий также может обеспечить конкурентное преимущество.

Применение в биофармацевтическом производстве

Наиболее непосредственное влияние новых технологий разделения заключается в производстве биотерапевтических препаратов, особенно моноклональных антител (mAbs), рекомбинантных белков и вакцин.

Для моноклональной очистки антител золотым стандартом давно является протеиновая хроматография А. Однако новые технологии, такие как адсорберы мембран белка А, синтетические пептидные лиганды и интегрированные системы непрерывного захвата, получают регуляторное признание. Например, комбинация мембранного устройства белка А с двухколонной хроматографической системой полировки позволяет работать 24/7 в компактном следе, с чистотой, превышающей 99% и выходом >95%.

Производство вакцин, особенно для вирусных векторов, используемых в генной терапии и вакцинах против COVID-19, выигрывает от мембранных адсорберов и тангенциальной фильтрации потока. Эти методы эффективно удаляют ДНК клеток-хозяев, белки и пустые капсиды при сохранении целостности вирусных частиц. Недавние исследования показали, что двухэтапный процесс с использованием адсорберов мембран анионного обмена с последующей ультрафильтрацией может достичь 10-кратного сокращения времени процесса по сравнению с обычной хроматографией.

Рекомбинантные ферменты, используемые в диагностике и промышленном биокатализе, часто требуют очистки, не нарушающей активность. Электрокинетические и микрофлюидные методы обеспечивают щадящее обращение, необходимое для этих чувствительных белков. Например, электрофорез свободного потока использовался для очистки рекомбинантного лаккейса с 80% восстановлением и 4-кратным увеличением специфической активности, превосходя традиционную ионообменную хроматографию.

В новой области клеточной и генной терапии , очищение плазмидной ДНК, мРНК и вирусных векторов требует методов разделения с высоким разрешением, которые могут обрабатывать низкие начальные концентрации и большие различия в размерах. Магнитные бусины аффинности и фракционирование микрофлюидного полевого потока адаптируются для этих сложных целей, предлагая потенциал для непрерывной обработки замкнутого цикла.