Применение капиллярного электрофореза и хроматографии в генетическом маркерном анализе

Введение

Генетический маркерный анализ лежит в основе широкого спектра научных дисциплин, от клинической диагностики и фармакогеномики до судебной идентификации и эволюционной биологии. Изучая конкретные последовательности ДНК или вариационные паттерны, исследователи могут точно определить связанные с болезнью аллели, проверить семейные отношения и проследить историю популяции. Точность таких анализов в значительной степени зависит от используемых технологий разделения и обнаружения. Среди наиболее мощных - капиллярный электрофорез (CE) и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). Эти методы обеспечивают разрешение, чувствительность и пропускную способность, необходимые для различения аллелей, которые отличаются одним нуклеотидом или несколькими парами оснований. В этой статье исследуются принципы, приборы и приложения этих двух методов в генетическом маркерном анализе, подчеркивая, как их совместное использование обеспечивает всестороннее понимание генома.

Капиллярный электрофорез в генетическом маркерном анализе

Принципы капиллярного электрофореза

Капиллярный электрофорез отделяет заряженные аналиты под воздействием электрического поля внутри узкого конденсированного капиллярного кремнезема (обычно 25-100 мкм внутреннего диаметра). Капилляр заполнен проводящим буферным раствором, рН и ионная прочность которого могут быть настроены на оптимизацию разделения. При применении высокого напряжения (10-30 кВ) положительно заряженные виды мигрируют к катоду и отрицательно заряженные виды к аноду. Эффективность разделения дополнительно повышается электроосмотической протокой (ЭОФ), объемным потоком буфера, который перемещается от анода к катоду из-за заряженной капиллярной стенки. Сочетание электрофоретической миграции и ЭОФ позволяет быстро, с высоким разрешением разделить фрагменты ДНК, РНК, белки и другие заряженные биополимеры.

Для генетических применений капилляр часто заполнен ситационной полимерной матрицей (например, линейным полиакриламидом или полиэтиленоксидом), которая разделяет фрагменты ДНК по размеру. Меньшие фрагменты мигрируют быстрее через полимерную сеть, в то время как более крупные фрагменты замедляются. Обнаружение обычно выполняется лазерно-индуцированной флуоресценцией (LIF) с использованием интеркалирующих красителей или фрагментоспецифичных флуоресцентных меток. Эта установка может разрешать фрагменты, отличающиеся одной парой оснований, что необходимо для таких приложений, как микросателлитное генотипирование и однонуклеотидный полиморфизм (SNP) обнаружение.

Инструменты и рабочий процесс

Современные инструменты CE для генетического анализа (например, Applied Biosystems SeqStudio, QIAGEN QIAxcel) интегрируют несколько капилляров (8, 16, 24 или 96), чтобы обеспечить параллельную обработку образцов. Ключевые компоненты включают в себя высоковольтный источник питания, систему впрыска образца (электрокинетический или гидродинамический), термостатированный капиллярный отсек и детектор флуоресценции. После инъекции амплифицированные фрагменты ДНК (часто из ПЦР) отделяются и обнаруживаются в режиме реального времени. Выходом является электроферограмма, где пиковые положения соответствуют размерам фрагментов (относительно внутреннего стандарта размера) и пиковые высоты или области указывают на относительное количество.

Типичный рабочий процесс для анализа микроспутников включает: (1) усиление ПЦР целевых локусов с использованием флуоресцентно меченных праймеров, (2) разбавление продукта ПЦР, (3) смешивание со стандартом размера и формамидом, (4) денатурацию при 95 °C, (5) быстрое охлаждение на льду и (6) впрыск в прибор CE. Программное обеспечение анализа данных автоматически вызывает аллели и количественно определяет пиковую интенсивность. Весь процесс, от инъекции до результата, часто занимает менее 30 минут за прогон.

Применение в генетическом маркерном анализе

Профилирование ДНК судебно-медицинской экспертизы

CE является основой судебно-медицинского короткого тандемного повторного (STR) анализа. Лаборатории во всем мире используют наборы на основе CE (например, PowerPlex, GlobalFiler) для усиления и разделения 15-24 локусов STR плюс половой маркер. Высокая дискриминационная сила (> 1 в 10 [FLT: 0]] 18 [[FLT: 1]] для неродственных лиц) в сочетании с разрешением одной базы CE позволяет надежно идентифицировать образцы следовой ДНК. Метод также используется для анализа Y-хромосомы STR, секвенирования митохондриальной ДНК и анализа метилирования ДНК в судебной эпигенетике.

Клиническая мутация обнаружение

CE обычно применяется для скрининга мутаций в генах, связанных с заболеванием. Например, при муковисцидозе анализ фрагментов на основе CE обнаруживает общие мутации CFTR, наблюдая изменения размеров фрагментов после переваривания фермента рестрикции или используя мультиплексную лигацию-зависимую амплификацию зонда (MLPA). В онкологии CE используется для обнаружения нестабильности микросателлита (MSI), отличительной чертой некоторых видов рака, таких как колоректальные и эндометрические опухоли. CE также позволяет количественный анализ вариаций числа копий генов путем сравнения пиковых соотношений между эталонными и целевыми последовательностями.

Генотипирование и SNP-анализ

В то время как высокопроизводительные SNP-решения являются общими, CE остается ценным для генотипирования с низкой и средней пропускной способностью, особенно в небольших лабораториях или для валидации исследований. Такие методы, как расширение одной базы (SBE), за которым следует разделение CE, могут подвергать сомнению несколько SNP в одном капилляре. Аналогично, CE может разделять аллельно-специфические продукты ПЦР на основе дифференциальной маркировки. В сельскохозяйственной генетике CE используется для генотипирования скота и сельскохозяйственных культур для селекции с помощью маркеров.

Преимущества и ограничения

CE предлагает несколько преимуществ: высокое разрешение (до 1 л.с.), требование небольшого объема выборки (1-10 нл инъекции), короткое время анализа (10-30 минут за пробег) и совместимость с автоматизацией. Ограничения включают необходимость флуоресцентной маркировки (добавление затрат на реагент), возможное смещение инъекции с электрокинетическим впрыском и требование тщательного обслуживания буфера и полимера, чтобы избежать засорения капилляров. Тем не менее, для приложений, требующих точного размера фрагментов ДНК в диапазоне 50-1000 б.с., CE остается методом выбора.

Хроматографические методы генетического анализа

Высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC)

ВЭЖХ разделяет молекулы на основе дифференциального разделения между стационарной фазой (упакованной колонной) и подвижной фазой (жидким растворителем) под высоким давлением. Для генетического анализа наиболее распространена обратная фаза ВЭЖХ (РП-ГПЛК) и подвижная фаза гидрофобного (например, С18) и гидроацетонитрильного градиента. Фрагменты ДНК, олигонуклеотиды и модифицированные нуклеозиды разделяются в соответствии с их гидрофобностью. Ионно-парная обратная фаза ВЭЖХ (ИП-РП-ГПЛК) особенно полезна для нуклеиновых кислот, поскольку ионопарный агент (например, триэтиламмоний ацетат) нейтрализует отрицательный заряд фосфатного хребта, позволяя удерживаться на гидрофобной стационарной фазе.

IP-RP-HPLC разделяет фрагменты ДНК по размеру (с более высоким разрешением для небольших фрагментов < 200 б/с) и может также отделять фрагменты одинаковой длины, которые отличаются последовательности (например, полиморфизмы одноцепочечной конформации). Используется УФ-детектирование (260 нм) или флуоресцентное обнаружение (с использованием интеркалирующих красителей или меченых праймеров). Современные системы УХПЛК (ультравысокопроизводительная жидкостная хроматография) с частицами суб-2 мкм достигают разделения в минутах, а не в десятках минут.

Денатурация HPLC (dHPLC)

Денатурирование HPLC является специализированной техникой для обнаружения мутаций. Он работает путем нагревания образца до частично денатурированных гетеродуплексов, образующихся между диким типом и мутантными цепями ДНК. Гетеродуплексы имеют более низкие температуры плавления и элюируют раньше, чем идеальные гомодуплексы на колонке, поддерживаемой при определенной температуре (обычно 50-70 ° C). dHPLC может обнаруживать однобазовые замены, небольшие вставки и делеции с высокой чувствительностью (95-99%) при оптимизации. Он не требует флуоресцентных меток или секвенирования, что делает его экономически эффективным инструментом скрининга известных и неизвестных мутаций.

Хроматография с размером исключения и аффинная хроматография

Хроматография с размером-исключением (SEC) отделяет фрагменты ДНК в основном по размеру и часто используется для очистки продуктов ПЦР или для анализа ДНК-белковых взаимодействий. Аффинная хроматография, используя ДНК-зонды, иммобилизованные на стационарной фазе, может обогащать конкретные последовательности (например, метилированные ДНК или сайты связывания факторов транскрипции) из сложных смесей. Эти методы дополняют CE и RP-HPLC в специализированных рабочих процессах.

Применение в генетическом маркерном анализе

Анализ метилирования ДНК

ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией (LC-MS) является золотым стандартом для количественной оценки глобального метилирования ДНК (например, 5-метилцитозина уровни). После гидролиза ДНК до нуклеозидов, РП-HPLC разделяет модифицированные нуклеозиды, и РС измеряет соотношение массы к заряду, что позволяет абсолютную количественную оценку. Этот подход используется в эпигенетике рака, исследованиях старения и биологии развития.

Обнаружение аддуктов ДНК и окислительного повреждения

ВЭЖХ-УФ или ВЭЖХ-флуоресценция могут обнаруживать аддукты ДНК, образующиеся при воздействии химических канцерогенов или активных форм кислорода. Анализируя характерные сроки удержания и спектры, исследователи могут идентифицировать специфические поражения и количественно оценить их обилие. Эти маркеры используются в токсикологии и исследованиях здоровья окружающей среды.

Олигонуклеотидная чистота и контроль качества

В синтезе зондов и праймеров для генетического анализа ВЭЖХ имеет важное значение для проверки чистоты. RP-HPLC может отделять неполные продукты синтеза, дезащитные олигонуклеотиды и флуоресцентные метки от полноразмерного продукта. Высокая чистота имеет решающее значение для надежных анализов ПЦР и гибридизации.

Преимущества и ограничения

HPLC предлагает отличную воспроизводимость, способность обрабатывать большие объемы выборки (мкл к мл) и совместимость с широким спектром режимов обнаружения (УФ, флуоресценция, МС). Он не требует флуоресцентной маркировки для многих применений (например, УФ-детектирование для анализа нуклеозидов). Ограничения включают более низкое разрешение для больших фрагментов ДНК (> 500 б. п.), более длительное время анализа по сравнению с CE для калибровки и более высокое потребление растворителей. Несмотря на эти компромиссы, хроматография остается незаменимой для анализа на уровне нуклеотидов и обнаружения модификаций.

Синергетическое использование капиллярного электрофореза и хроматографии

Дополнительные сильные стороны

Капиллярный электрофорез и хроматография предоставляют дополнительную информацию о генетических маркерах. CE превосходит в быстром, с высоким разрешением размерах фрагментов ДНК в диапазоне 50-1000 б. п., что делает его идеальным для генотипирования STR, анализа микросателлита и анализа фрагментов ампликона. Хроматография (особенно IP-RP-HPLC) предлагает превосходное разделение небольших олигонуклеотидов, модифицированных нуклеозидов и аддуктов, а также последовательно-зависимые разделения. При совместном использовании они позволяют комплексную характеристику генетического материала: CE определяет длины фрагментов, в то время как HPLC обнаруживает химические модификации, статус метилирования и чистоту.

Пример интеграции рабочих процессов

Типичный интегрированный рабочий процесс для анализа гена-кандидата может протекать следующим образом: (1) Извлечение геномной ДНК из образцов пациентов. (2) Усилить целевые экзоны ПЦР. (3) Анализировать размер и концентрацию продукта ПЦР с помощью CE (используя чип ДНК 1000 на Agilent Bioanalyzer или инструмент CE) для подтверждения правильной амплификации и отсутствия неспецифических продуктов. (4) Проводить скрининг dHPLC ампликонов ПЦР для выявления потенциальных мутаций (детектирование гетеродуплекса). (5) Последовательность аберрантных образцов для подтверждения мутации. (6) Для эпигенетических исследований бисульфит преобразует ДНК, амплифицирует область и анализирует образцы метилирования на основе анализа фрагментов CE (используя чувствительные к метилированию ферменты или пиросеквенирование) и / или HPLC-MS для количественной оценки глобальных уровней метилирования. Эта комбинация использует скорость CE для калибровки и способности скрининга мутации dHPLC, уменьшая количество образцов, которые требуют дорогостоящего секвенирования.

Судебная экспертиза

В криминалистических лабораториях CE является основным инструментом для профилирования STR, но хроматография может играть вспомогательную роль. Например, при работе с деградированными или ингибированными образцами очистка HPLC (с использованием спиновых колонок или SEC) может удалять ингибиторы PCR (например, гуминовые кислоты, гематин) перед анализом CE. Альтернативно, если образец содержит смеси ДНК от нескольких лиц, HPLC может использоваться для выбора размеров фракций перед амплификацией STR, упрощая интерпретацию. Кроме того, для анализа маркеров Y-хромосомы или секвенирования митохондриальной ДНК очищенные продукты HPLC приводят к более чистым электроферограммам CE.

Клинические диагностические протоколы

В клинической генетике часто последовательно используются CE и HPLC. Например, при скрининге новорожденных на такие состояния, как тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID), CE измеряет иссечение T-клеточных рецепторов (TREC) в качестве маркера тимического выхода. HPLC затем используется для подтверждения результатов путем измерения активности аденозиндеаминазы или метаболитов пурина. При скрининге гемоглобинопатии HPLC (с использованием колонок катион-обмена) разделяет варианты гемоглобина, в то время как CE подтверждает наличие специфических делеций гена α- или β-глобина или точечных мутаций. Комбинация обеспечивает высокую диагностическую точность для сложных генетических нарушений.

Новые синергии: CE-MS и HPLC-MS

Связывание CE или HPLC с масс-спектрометрией усиливает их аналитическую мощность. CE-MS набирает тягу для метаболомики и протеомики, но менее распространено для прямого анализа ДНК из-за проблем ионизации. Однако для анализа модификаций ДНК (например, 5-гидроксиметилцитозина) HPLC-MS/MS остается методом выбора, обеспечивающим как разделение, так и структурную идентификацию. Исследователи могут использовать HPLC-MS для скрининга неизвестных модификаций и затем использовать CE для подтверждения размера фрагментов, содержащих эти модификации. По мере улучшения приборов, дефисированные методы станут более доступными для рутинного генетического анализа.

Практические соображения и выбор метода

Факторы, влияющие на выбор

Выбор между CE и HPLC зависит от конкретного генетического маркера, пропускной способности выборки, ограничений по стоимости и доступной инфраструктуры.

Контроль качества и стандартизация

Оба метода требуют надежных мер контроля качества. Анализ СЕ должен включать аллельные лестницы, внутренние стандарты размера и положительные/отрицательные элементы управления для каждого прогона. Методы ВЭЖХ требуют уравновешивания колонок, испытаний пригодности системы (например, воспроизводимость во времени удержания, пиковая симметрия) и использования сертифицированных эталонных материалов. Отклонения во времени миграции или пиковых формах могут указывать на деградацию колонн или проблемы с буфером. Регулярное техническое обслуживание и калибровка обеспечивают надежные результаты в прогонах и лабораториях.

Будущие направления

Технологические инновации продолжают расширять возможности CE и HPLC для генетического анализа. Микрожидкие чипы CE (lab-on-a-chip) интегрируют подготовку образцов, ПЦР и разделение на одном устройстве, сокращая время анализа до минут и объемы образцов до нанолитров. Разрабатываются переносные инструменты CE для генетического тестирования в полевых условиях. Аналогичным образом, колонки LC (UHPLC) сверхвысокого давления с частицами суб-2 мкм улучшают разрешение и скорость, позволяя в режиме реального времени контролировать модификации ДНК.

Интеграция рабочих процессов CE и HPLC с секвенированием следующего поколения (NGS) является еще одной тенденцией. CE может использоваться для контроля качества библиотек NGS (размер и количественная оценка), в то время как HPLC может очищать конкретные размеры фрагментов перед секвенированием. В эпигенетических исследованиях HPLC-MS остается золотым стандартом для анализа модификации оснований, в то время как методы на основе CE появляются для быстрого анализа метилирования одной клетки. Объединение двух методов через ортогональное разделение обеспечит более глубокое понимание генетической изменчивости и функции.

Заключение

Капиллярный электрофорез и хроматография являются основополагающими инструментами в генетическом маркерном анализе, каждый из которых предлагает уникальные преимущества. CE обеспечивает беспрецедентную скорость и разрешение для размера фрагментов ДНК, что делает его незаменимым для судебно-медицинской типизации STR, клинического генотипирования и обнаружения мутаций. Хроматография, особенно HPLC в различных формах, обеспечивает надежное разделение олигонуклеотидов, модифицированных нуклеозидов и аддуктов, позволяя подробно проводить эпигенетический и химический анализ. При использовании синергетически эти методы позволяют исследователям и клиницистам получать полную картину генетического материала - от базового состава до длины фрагмента до статуса модификации. Поскольку обе технологии продолжают развиваться, с миниатюризацией, автоматизацией и связью с масс-спектрометрией, их роли в генетическом анализе будут только расширяться, что еще больше продвинет наше понимание генома и его роли в здоровье, болезни и идентичности.