Применение нанопорного секвенирования в реальном времени геномного наблюдения

Нанопорное секвенирование появилось в качестве трансформационного подхода в геномике, позволяя ученым декодировать молекулы ДНК и РНК в режиме реального времени с беспрецедентной портативностью. В отличие от традиционных методов секвенирования, которые требуют обширной подготовки образцов и пакетной обработки, технология нанопор генерирует длинные считывания и дает результаты в течение нескольких минут после начала запуска. Эта способность оказалась особенно мощной для геномного наблюдения - непрерывного мониторинга геномов патогенов для отслеживания передачи, обнаружения мутаций и информирования ответов общественного здравоохранения. Во время недавних вспышек Эболы, Зики и COVID-19, нанопорное секвенирование было развернуто в полевых условиях и справочных лабораториях, демонстрируя свою полезность в качестве фронтового инструмента для управления вспышками в режиме реального времени.

Как работает секвенирование нанопор

Секвенирование нанопор основано на простом, но элегантном принципе: одна молекула ДНК или РНК проходит через поры нанометрового масштаба, встроенные в синтетическую мембрану. По мере того, как молекула транслокируется через пору, она нарушает ионный ток, протекающий через мембрану. Величина и продолжительность этих текущих изменений специфичны для каждого нуклеотида - или группы нуклеотидов - позволяя определять последовательность в режиме реального времени. Этот прямой, электрический метод обнаружения устраняет необходимость ферментативной амплификации (например, ПЦР) или флуоресцентной маркировки, которые требуются другими платформами секвенирования. Весь процесс контролируется запатентованной интегральной схемой, специфичной для приложений (ASIC), которая измеряет текущие изменения на тысячах пор одновременно, что позволяет высокопроизводительное секвенирование из одного устройства.

Ключом к переносимости технологии является проточная клетка — расходный материал, который содержит нанопоры и микрофлюидики. Такие устройства, как MinION (достаточно малый, чтобы поместиться в карман) и более высокая пропускная способность GridION, предназначены для развертывания на местах, в то время как серия PromethION предлагает еще большую емкость для крупномасштабных проектов наблюдения. Поскольку платформа может секвенировать ДНК непосредственно или через РНК (с использованием прямого секвенирования РНК), она обеспечивает универсальное решение для генотипирования целых геномов, выявления структурных вариантов и обнаружения эпигенетических модификаций без дополнительных этапов химического преобразования.

Основные преимущества геномного наблюдения

Нанопорное секвенирование предлагает несколько различных преимуществ, которые делают его особенно подходящим для геномного наблюдения в режиме реального времени:

• Данные в режиме реального времени: Данные анализируются, как только молекула проходит через пору, что позволяет исследователям увидеть предварительные результаты в течение нескольких минут после начала прогона. Это позволяет быстро принимать решения во время вспышек, таких как идентификация видов патогена или ключевых мутаций до того, как будет собран полный геном.
• Длинные длины считывания:] Нанопорное секвенирование обычно производит считывания длиной от десятков до сотен килобаз. Длинные считывания имеют решающее значение для разрешения повторяющихся областей в вирусных и бактериальных геномах, обнаружения больших структурных вариантов и сборки полных геномов без пробелов, общих в короткочитанных сборках.
• Портативность и низкое энергопотребление:] MinION подключается к ноутбуку через USB, работает от батареи и весит всего 100 грамм. Это делает его доступным для развертывания в отдаленных клиниках, аэропортах, мобильных лабораториях или даже на Международной космической станции, что позволяет вести наблюдение в местах, где традиционная инфраструктура секвенирования недоступна.
• Экономическая эффективность: Первоначальные капитальные вложения в MinION составляют часть от объема, необходимого для высокопроизводительных систем Illumina. Потребляемые материалы — потоки клеток и комплекты секвенирования — относительно недороги, а отсутствие необходимости в дорогостоящих инструментах для подготовки библиотек снижает общие эксплуатационные расходы для небольших лабораторий и групп реагирования на вспышки.
• Прямая РНК-секвенирование: Способность непосредственно секвенировать РНК (без обратной транскрипции и амплификации) сохраняет базовые модификации, такие как N6-метиладенозин, что может быть важно для понимания репликации вируса и взаимодействия хозяина с патогеном. Эта особенность все чаще используется в эпиднадзоре РНК-вирусов, таких как SARS-CoV-2 и грипп.

Сравнение с другими технологиями секвенирования

Чтобы понять нишу, занимаемую секвенированием нанопор, полезно сравнить его с доминирующими платформами для чтения в коротких прочтениях (например, Illumina) и другими вариантами для чтения в длинных прочтениях (например, PacBio). Секвенирование в Иллюминах обеспечивает очень высокую точность (99,9% точности базового уровня) и высокую пропускную способность при низкой стоимости за базу, но оно дает показания только 150-300 оснований. Это ограничивает его способность разрешать повторяющиеся области, фазовые гаплотипы и обнаруживать большие структурные варианты. Секвенирование в HiFi PacBio сочетает в себе длинные прочтения с высокой точностью (аналогично Illumina), но требует больших капитальных вложений и менее портативно. Секвенирование в нанопорах, в то время как исторически критикуется за более высокие показатели ошибок (~ 5-15% на чтение изначально), значительно улучшилось с обновлениями химии пор, алгоритмов базового прочтения и методов консенсуса. С последними R10.4 проточными клетками и моделями базисного прочтения с высокой точностью, точность консенсуса может

Тематические исследования: Реакция на вспышки в реальном времени

Вирус Эбола (2014–2016 Вспышка в Западной Африке)

Одно из самых ранних крупномасштабных развертываний секвенирования нанопор для эпиднадзора за вспышками произошло во время эпидемии Эболы в Западной Африке. Исследователи использовали MinION для секвенирования геномов вируса Эбола из образцов пациентов в Гвинее и Сьерра-Леоне. Быстрый поворот — от сбора образцов до анализа генома менее чем за 24 часа — позволил эпидемиологам отслеживать цепочки передачи и определять, развивается ли вирус таким образом, что это может повлиять на диагностику, лечение или вакцины. Знаковое исследование, опубликованное в Природа , продемонстрировало, что секвенирование нанопор в реальном времени предоставило действенные данные для контроля вспышки, несмотря на сложные полевые условия (см. Quick et al., Nature, 2016 .

Вирус Зика (2015–2016)

Во время эпидемии Зика в Северной и Южной Америке нанопорное секвенирование использовалось для быстрого генерирования целых геномных последовательностей от комар-векторов и пациентов с человеком. Возможность секвенирования непосредственно из низкотитровых образцов без обширного усиления помогла исследователям отслеживать распространение вируса на континентах и отслеживать мутации, которые могут быть связаны с повышенной вирулентностью или трансмиссивностью. Портативная природа MinION была особенно ценна в условиях ограниченных ресурсов, где центральная лабораторная инфраструктура была дефицитной.

COVID-19 Пандемия

Глобальная пандемия SARS-CoV-2 ускорила принятие секвенирования нанопор для геномного наблюдения. Сеть ARTIC (сотрудничество во главе с Институтом Wellcome Sanger и партнерами) разработала протокол на основе усилителя для секвенирования всего генома SARS-CoV-2 на платформах MinION и GridION. Этот протокол стал одним из наиболее широко используемых методов во всем мире, способствуя миллионам последовательностей SARS-CoV-2, хранящихся в общедоступных базах данных. Поток данных в реальном времени позволил лабораториям общественного здравоохранения быстро идентифицировать варианты беспокойства (например, Alpha, Delta, Omicron) и отслеживать их появление и распространение. Такие страны, как Великобритания, Южная Африка и Бразилия, в значительной степени полагались на секвенирование нанопор для информирования о мерах блокировки, ограничениях на поездки и стратегиях развертывания вакцин. Обзор усилий по геномному надзору отмечает, что секвенирование нанопор было важным в обеспечении быстрых геномных данных как в условиях высокого, так и низкого дохода (см. ]Gardy and Loman,

• Показатели ошибок при однократном чтении:] Даже при недавних улучшениях точность чтения в сыром виде ниже, чем у платформ с коротким чтением. Это особенно проблематично для обнаружения низкочастотных вариантов, таких как ранние стадии резистентности к лекарственным средствам или квазивидов в вирусных популяциях. Подходы консенсуса (построение единой консенсусной последовательности из многих чтений) смягчают это, но варианты субконсенсуса требуют тщательного вызова вариантов со специализированными инструментами (например, Medaka, Clair3, Nanopolish).
• Базовая задержка: В то время как потоки данных в реальном времени, преобразование электрических сигналов в базы (базовый вызов) требует вычислительных ресурсов. Базовый вызов в реальном времени на GPU устройства улучшился, но модели с высокой точностью (например, «суперточный» режим) все еще могут вводить задержки от минут до часов, в зависимости от пропускной способности.
• Простое качество и смещения: Успешное секвенирование нанопор требует высокой молекулярной массы ДНК или неповрежденной РНК. Деградированные образцы, распространенные в полевых условиях, могут привести к более коротким показаниям и снижению выходных данных. Кроме того, этапы усиления, используемые в некоторых протоколах (например, схемы усилителей ARTIC), могут вводить ПЦР-смещение и ограничивать обнаружение неожиданных геномных перестановок.
• Стоимость на геном для крупномасштабных исследований:] Хотя первоначальные инвестиции низкие, стоимость на геном может быть выше, чем у Illumina для очень крупных проектов (тысячи геномов) из-за стоимости проточных клеток и более низкой пропускной способности за пробег. Для программ наблюдения, требующих быстрого оборота на умеренном количестве образцов (10–100 в неделю), секвенирование нанопор является высококонкурентным, но для популяционного секвенирования десятков тысяч образцов все еще доминируют платформы с короткими прочтениями.
• Стандартизация и воспроизводимость: Быстрая эволюция химий пор, алгоритмов базисного календаря и наборов для подготовки библиотек означает, что протоколы часто меняются. Это может бросить вызов воспроизводимости результатов с течением времени и между лабораториями. Область работает в направлении стандартизированных лучших практик, таких как опубликованные Консорциумом по нанопорному секвенированию.

Новые инновации и будущие направления

Нанопоры секвенирования ландшафта продолжает быстро развиваться. Несколько ключевых областей развития обещают еще больше повысить свою роль в геномном надзоре:

Улучшенная точность и исправление ошибок

Новые белковые нанопоры (например, R10.4 и R10.5) были разработаны для более точного разрешения оснований, особенно в гомополимеровых областях (например, AAAA), которые исторически вызывали высокие частоты ошибок. В сочетании с базовыми каллерами глубокого обучения (например, Bonito, Dorado), точность считывания в сыром виде теперь обычно превышает 98% для консенсуса Q20 +. Методы коррекции ошибок, которые включают данные с коротким чтением или используют консенсус из нескольких молекул, также автоматизируются, делая высококачественные геномы, получаемые из данных только нанопор.

Метагеномика в реальном времени и открытие патогенов

Помимо целенаправленного наблюдения за известными патогенами, секвенирование нанопор применяется к нецелевой метагеномике — секвенирование всех нуклеиновых кислот в клиническом или экологическом образце. потоковое воспроизведение в реальном времени позволяет «живую» классификацию считываний по справочным базам данных (например, с использованием EPI2ME, облачной платформы анализа). Это может идентифицировать новые патогены, такие как новые штаммы гриппа или гены устойчивости к противомикробным препаратам, в течение нескольких минут после запуска. Например, ВОЗ ВОЗ выделила потенциал метагеномики нанопор для раннего выявления заболевания X — гипотетического неизвестного патогена, который может вызвать будущую пандемию.

Прямое обнаружение метилирования и эпигенетических модификаций

Нанопорное секвенирование обнаруживает не только основания, но и модификации оснований, поскольку модифицированные нуклеотиды изменяют сигнал ионного тока характерными способами. Это позволяет непосредственно обнаруживать модификации ДНК (например, 5-метилцитозина, 6-метиладенина) и РНК без дополнительной химической обработки. В эпиднадзоре это может помочь контролировать изменения в моделях вирусной модификации, которые могут повлиять на уклонение иммунитета хозяина или репликационную кинетику.

Интегрированные портативные лаборатории

Несколько инициатив разрабатывают полностью переносные установки секвенирования на солнечных батареях, которые сочетают в себе MinION с ноутбуком, небольшой центрифугой и портативным термоциклером ПЦР (или изотермическим усилителем). Эти установки «лаборатории в рюкзаке» тестируются в отдаленных регионах Африки, Южной Америки и Юго-Восточной Азии для наблюдения в режиме реального времени за такими заболеваниями, как лихорадка Ласса, лихорадка денге и желтая лихорадка. Цель состоит в том, чтобы достичь времени отбора проб менее шести часов, включая подготовку библиотеки и базисный вызов.

Практические соображения по осуществлению нанопорного наблюдения

Для учреждений общественного здравоохранения и лабораторий, рассматривающих возможность применения нанопорного секвенирования для геномного наблюдения, стоит учитывать несколько стратегических факторов:

• Требования к пропускной способности: Оценить количество образцов, подлежащих обработке в неделю. MinION может запускать одну проточную ячейку за раз, с пропускной способностью, как правило, в диапазоне от 10 до 50 Гб за пробег (в зависимости от длины считывания и заполняемости пор). Для более высокой пропускной способности более уместны GridION (пять проточных ячеек) или PromethION (24 или 48 проточных ячеек).
• Биоинформатическая инфраструктура: В то время как производитель предоставляет удобное для пользователя программное обеспечение (MinKNOW, EPI2ME), более продвинутый анализ (сборка de novo, вызов вариантов, филогенетический анализ) требует знакомства с инструментами командной строки или облачными платформами. Программы обучения и ресурсы сообщества (такие как ] Полевые биоинформатические трубопроводы ) помогают снизить барьер.
• Контроль качества: Установление внутренних средств контроля (например, стандарты спайка, отрицательные средства контроля) имеет решающее значение для мониторинга загрязнения и оценки эффективности секвенирования. Многие успешные программы наблюдения используют комбинацию нанопор и подтверждающего короткочитательного секвенирования для критических образцов.
• Обмен данными и совместимость: Геномное наблюдение в реальном времени наиболее эффективно, когда последовательности быстро передаются через публичные репозитории (GISAID, GenBank, ENA). Для облегчения воспроизводимости следует сообщать метаданные, специфичные для нанопор (например, версия пор, версия базисного кабеля).

Заключение

Секвенирование нанопор фундаментально изменило практику геномного наблюдения, предоставив в режиме реального времени портативный и все более точный метод декодирования геномов патогенов. Его успешное развертывание во время вспышек Эболы, Зики и COVID-19 демонстрирует его ценность для быстрого обнаружения и мониторинга инфекционных угроз. В то время как такие проблемы, как частота ошибок, стандартизация и стоимость для очень крупных проектов, сохраняются, продолжающиеся улучшения в разработке пор, алгоритмах базального калькулирования и интегрированных портативных системах, неуклонно преодолевают эти барьеры. По мере развития технологии секвенирование нанопор готово стать стандартным инструментом в глобальном инструментальном наборе наблюдения, что позволит быстрее, более справедливые ответы на возникающие инфекционные заболевания и в конечном итоге укрепить готовность к пандемии во всем мире.