Срочная потребность в новых антибиотиках

Устойчивость к антибиотикам является одной из самых насущных глобальных угроз здоровью. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предупредила, что без срочных действий обычные инфекции и незначительные травмы могут снова стать смертельными . Только в Соединенных Штатах ежегодно происходит более 2,8 миллиона устойчивых к антибиотикам инфекций, что приводит к более чем 35 000 смертей по данным CDC. Традиционные источники антибиотиков — почвенные бактерии и грибы — были широко добыты, что приводит к повторному открытию известных соединений. Новые антибиотики отчаянно необходимы для борьбы с резистентными штаммами, такими как Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas aeruginosa и Mycobacterium tuberculosis . Проектирование биохимических путей в инженерных организмах предлагает устойчивый, масштабируемый маршрут для обнаружения и производства совершенно новых классов антибактериальных соединений.

Основы биохимических путей для синтеза антибиотиков

Антибиотики — это натуральные продукты, синтезируемые микроорганизмами через сложные биохимические пути. Эти пути обычно состоят из серии фермент-катализированных реакций, которые превращают простые предшественники в конечную биологически активную молекулу. Понимание этих путей необходимо для их перепроектирования для получения новых вариантов или совершенно новых каркасов.

Первичный и вторичный метаболизм

Биосинтез антибиотиков часто возникает из вторичного метаболизма — путей, которые не являются необходимыми для роста, но приносят экологические преимущества. Вторичные метаболиты, включая антибиотики, строятся из первичных метаболитов, таких как аминокислоты, ацетил-КоА и малонил-КоА. Ключевые классы ферментов включают поликетид-синтазы (PKSs), нерибосомные пептидные синтетазы (NRPSs) и адаптируют ферменты, такие как метилтрансферазы, гидроксилазы и гликозилтрансферазы.

Ключевые классы ферментов

  • Поликетидные синтазы (PKSs): Эти многомодульные ферменты собирают поликетидные цепи путем последовательной конденсации клейзена. PKS типа I особенно важны для макролидных антибиотиков, таких как эритромицин. Генетическое манипулирование доменами PKS может генерировать измененные поликетидные продукты.
  • Нерибосомные пептидные синтезаторы (NRPS): NRPS синтезируют пептиды с использованием модульной логики, включающей необычные аминокислоты и генерирующие костяные структуры, обнаруженные в антибиотиках, таких как ванкомицин и даптомицин. Замена домена или модульная инженерия могут производить новые пептидные антибиотики.
  • Тайлоринговые ферменты: После сборки каркаса ядра, пошив ферментов модифицирует молекулу для придания биоактивности, стабильности или транспорта. Примеры включают цитохром P450 монооксигеназы и гликозилтрансферазы.

Проектирование путей: от открытия генов до сборки путей

Процесс разработки новых антибиотиков начинается с идентификации генетических чертежей — биосинтетических генных кластеров (BGCs), которые кодируют необходимые ферменты. Достижения в секвенировании генома и биоинформатике позволили добывать бактериальные геномы для BGC, которые могут производить неизвестные соединения [[Nature Reviews Microbiology review on genome mining]].

Идентификация генов и кластерная добыча

Вычислительные инструменты, такие как антиSMASH, позволяют ученым быстро идентифицировать BGC в микробных геномах. Эти кластеры часто содержат гены синтазы ядра (например, гены PKS или NRPS) вместе с генами регуляторной и резистентной природы. Предсказанные BGC могут быть клонированы из ДНК окружающей среды или синтезированы de novo. Молчаливые кластеры - те, которые не экспрессируются в лабораторных условиях - могут быть активированы посредством рефакторинга путей или гетерологичной экспрессии.

Инженерные стратегии Pathway

  • Рефакторинг: Удаление нативных регуляторных элементов и замена их сильными, индуцируемыми промоторами может резко увеличить урожайность.
  • Обмен домена и модуля: Для модульных PKS и NRPS замена одного домена на гомолог может изменить мономерный строительный блок, генерируя новый продукт.
  • Энзимная направленная эволюция: Итеративный мутагенез и скрининг могут улучшить активность ферментов, объем субстрата или специфичность для желаемых аналогов антибиотиков.

Выбор хоста и гетерогенное выражение

Выбор подходящего организма-хозяина имеет решающее значение. Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae предпочитают за их генетическую тягу и быстрый рост, но им может не хватать конкретных предшественников или посттрансляционных механизмов. Streptomyces, естественный источник многих антибиотиков, предлагают более родную среду, но медленнее инженерируют. Общие стратегии включают экспрессию целых BGC в высокоурожайных Streptomyces шасси или использование подхода plug-and-play в E. coli, обеспечивая пути предшественников.

Современные инструменты, ускоряющие дизайн дорожек

Синтетическая биология и геномная инженерия произвели революцию в построении биохимических путей. В настоящее время для ускорения цикла проектирования-строительства-испытания-обучения регулярно используются несколько передовых методов.

CRISPR-Cas9 для точного редактирования генома

CRISPR-Cas9 позволяет целенаправленно вставлять, удалять или заменять гены пути непосредственно в геноме хозяина. В Streptomyces системы на основе CRISPR значительно сократили время, необходимое для выбивания конкурирующих путей или интеграции больших кластеров генов. Эта технология также облегчает редактирование без маркеров, что необходимо для производства штаммов, подходящих для промышленной ферментации (статья ACS Synthetic Biology о CRISPR в Streptomyces].

Направленная эволюция и оптимизация ферментов

Направленная эволюция имитирует естественный отбор в лаборатории. Создавая библиотеки вариантов ферментов посредством случайного мутагенеза или подверженной ошибкам ПЦР, исследователи могут выбирать для повышения каталитической эффективности, измененной специфичности субстрата или повышенной стабильности. Например, направленная эволюция использовалась для разработки цитохрома P450, который гидроксилатирует ненатуральные субстраты, что позволяет производить производные антибиотиков с лучшими фармакологическими свойствами.

Вычислительное моделирование и искусственный интеллект

Вычислительные инструменты теперь играют центральную роль в разработке путей. Модели, основанные на анализе баланса потока, могут прогнозировать метаболические узкие места и направлять стратегии нокаута или переэкспрессии генов. Алгоритмы машинного обучения, обученные на больших наборах данных известных BGC и путей, могут предлагать новые комбинации ферментов, которые могут производить ранее невидимые антибиотики. Такие инструменты, как PathPred и RetroPath, обеспечивают предложения по прямому и ретросинтетическому пути, ускоряя фазу проектирования.

Преодоление проблем в строительстве дорожек

Несмотря на наличие мощных инструментов, разработка и внедрение новых антибиотиков остается сложной задачей. Необходимо устранить многие препятствия для перехода от концепции к производству.

Сложность и регуляторные барьеры

Естественные пути антибиотиков часто включают десятки ферментов, несколько регуляторных слоев и сложные петли ингибирования обратной связи. Воспроизведение этой сложности в гетерогенном хозяине может привести к низким выходам или заглушению пути. Требуется тщательная настройка сильных сторон промотора, числа копий генов и концентрации индукторов. Кроме того, многие промежуточные пути или конечные продукты токсичны для клетки-хозяина, что требует совместной экспрессии генов устойчивости.

Токсичность и метаболическое бремя

Сама активность, которая делает антибиотики ценными — прерывание синтеза бактериальной клеточной стенки, синтез белка или репликацию ДНК — также может нанести вред хозяину производства. Стратегии преодоления этого включают использование ортогональных систем экспрессии, разделение путей внутри органелл (например, пероксисомы в дрожжах) или разработку штаммов хозяина с устойчивыми мишенями. Метаболическая нагрузка от высокой экспрессии больших синтаз также может замедлить рост; динамический метаболический контроль с использованием биосенсоров может помочь сбалансировать производство и жизнеспособность.

Масштабируемость и ферментация

Пути, которые работают в колбах для встряхивания, могут не сработать при масштабировании на промышленные биореакторы из-за ограничения кислорода, проблем с подкормкой или чувствительности к сдвигу. Разработка надежных процессов ферментации требует обширной оптимизации состава среды, режимов кормления и очистки ниже по течению. Достижения в непрерывной ферментации и системах без клеток предлагают альтернативные пути для масштабируемого производства.

Будущие направления и влияние

Будущее нового производства антибиотиков лежит в интеграции нескольких дисциплин. Синтетическая биология будет продолжать обеспечивать стандартизированные генетические части и модульное шасси. Высокопроизводительный синтез ДНК и автоматизированное клонирование ускорят конструирование тысяч вариантов путей. Искусственный интеллект, вероятно, будет направлять разработку совершенно новых биосинтетических путей в силико с использованием глубокого обучения для прогнозирования взаимодействий ферментов-субстратов.

Одна из интересных перспектив — разработка универсальных платформ-хозяев, которые можно быстро перепрограммировать для производства любого желаемого антибиотика при индукции. Такие системы в сочетании с оптимизацией штаммов, основанной на машинном обучении, могут резко сократить временную шкалу от идентификации цели до производства. Кроме того, те же принципы инженерного пути могут быть применены для производства других ценных натуральных продуктов — противораковых агентов, иммунодепрессантов и биотоплива.

Для финансирования и координации этих усилий необходимы совместные усилия, такие как глобальные инициативы по исследованию устойчивости к противомикробным препаратам , которые при устойчивых инвестициях могут пополнить ряд новых антибиотиков, обеспечивая врачей эффективным оружием против лекарственно-устойчивых инфекций.

Заключение

Разработка биохимических путей для новых антибиотиков является весьма перспективной стратегией для борьбы с растущим кризисом устойчивости к антибиотикам. Используя геномную разработку, инструменты синтетической биологии (включая CRISPR, направленную эволюцию и вычислительное моделирование), исследователи могут создавать и оптимизировать пути, которые производят совершенно новые соединения. Хотя проблемы в сложности путей, токсичности и масштабируемости остаются, текущие инновации быстро превращают эти препятствия в возможности. Продолжающаяся конвергенция биоинформатики, редактирования генов и метаболической инженерии в конечном итоге обеспечит устойчивое, экономически эффективное производство антибиотиков следующего поколения - спасение бесчисленных жизней во всем мире.