Критическая потребность в васкуляризации в тканевой инженерии

Регенеративная медицина давно стремилась создать полностью функциональные органы в лаборатории, но постоянным узким местом было отсутствие встроенного & #8209; в кровоснабжении. Без перфузионных микрососудистых сетей, инженерные ткани не могут поддерживать метаболические потребности клеток за несколько сотен микрометров. Диффузия сама по себе не может доставить достаточно кислорода и питательных веществ в ядро конструкции, что приводит к гибели клеток и недостаточности трансплантата. Развитие перфузионных микрососудистых сетей представляет собой прорыв, который решает это фундаментальное ограничение, позволяя изготовление толстых, жизнеспособных тканей, которые могут интегрироваться с циркуляцией реципиента.

Микрососудистые сети — это сложная система доставки организма, состоящая из артериол, капилляров и венул. Они отвечают за газообмен, транспорт питательных веществ, удаление отходов и иммунное наблюдение. В естественных органах эти сети иерархически организованы и точно упорядочены в соответствии с местными метаболическими потребностями. Воспроизведение такой сложности в инженерной конструкции потребовало междисциплинарного сотрудничества в клеточной биологии, материаловедении, микрофлюидике и биопечати. Прогресс в последнее десятилетие переместил область из теоретической возможности в материальные прототипы, с исследователями, теперь способными печатать васкуляризированные ткани и демонстрировать перфузии in vivo.

Биология микрососудистых сетей

Для построения искусственных микрососудистых сетей необходимо сначала понять биологический план. Капилляры выстланы эндотелиальными клетками, которые образуют полу- и #8209;проницаемый барьер, регулирующий молекулярный транспорт. Эти эндотелиальные трубки стабилизируются перицитами и клетками гладкой мускулатуры, которые обеспечивают механическую поддержку и реагируют на биомеханические сигналы. Внеклеточный матрикс, окружающий сосуды, содержит сложную смесь белков, таких как коллаген, ламинин и фибронектин, которые направляют формирование сосудов и поддерживают проходимость.

Ключевые сигнальные пути управляют созданием и ремоделированием микрососудов. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) стимулирует ангиогенез, в то время как ангиопойетин & #8209;1 способствует созреванию и стабильности сосудов. Platelet & #8209; полученный фактор роста (PDGF) набирает перициты в зарождающиеся сосуды и трансформирует фактор роста & #8209;β (TGF & #8209;β) модулирует ремоделирование сосудов. В инженерных системах эти факторы должны быть представлены в пространственно и временно контролируемых дозах. Слишком много VEGF, например, дает протекающие, незрелые сосуды; слишком мало не может инициировать прорастание. Задача заключается в воссоздании динамической биохимической среды, которую обеспечивают естественные ткани.

Не менее важна физическая архитектура микрососудистой системы. Диаметры сосудов колеблются от 5-10 мкм в капиллярах до 30-100 мкм в артериолах. Ветвящиеся структуры следуют фрактальной геометрии, которая оптимизирует поток жидкости и минимизирует сопротивление. Природные сети также адаптируются к напряжению сдвига через пути механотрансдукции, которые регулируют калибр сосуда и толщину стенки. Поэтому любая инженерная сеть должна не только соответствовать масштабу и геометрии родной сосудистой системы, но и реагировать на гемодинамические силы, чтобы оставаться функциональной с течением времени.

Основные проблемы в инженерных перфузионных сетях

Несмотря на значительный прогресс, создание функциональных микрососудистых сетей в инженерных органах остается сложным. Основными препятствиями являются:

  • Формирование и стабильность сосудов: Эндотелиальные клетки должны самостоятельно‑собираться в трубки с надлежащей полярностью и плотными соединениями.Без поддерживающих фресочных клеток вновь образованные сосуды часто регрессируют или становятся гиперпроницаемыми.
  • Беззагружаемая интеграция с кровоснабжением хозяина: Иноскуляции — связь между инженерными и хозяевыми сосудами — должны происходить быстро, чтобы предотвратить ишемию. Это требует точного пространственного выравнивания и предотвращения свертывания крови.
  • Структурная целостность при трансплантации: Микроскопические сосуды хрупкие. Обработка и хирургические манипуляции могут раздавить или разорвать их, что приводит к кровоизлиянию или окклюзии.
  • Быстрое и равномерное перфузии: Весь объем ткани должен быть достигнут в течение нескольких минут после соединения, чтобы предотвратить гибель ядра. Это требует иерархической сети с низкими путями сопротивления.
  • Расширение до органов размером с человека‑:] В то время как блок ткани размером 1 см3 может быть васкуляризирован в блюде, масштабирование до целой печени или почки требует миллионов точно расположенных микроканалов.

Преодоление ограничений диффузии

Фундаментальным физическим ограничением является предел диффузии кислорода в ткани — примерно 100-200 мкм. Без сосудистой сети клетки, расположенные дальше, чем это расстояние от источника питательных веществ, погибнут. Инженерные конструкции толще нескольких сотен микрон должны поэтому включать в себя перфузионные каналы. Ранние попытки использовали пористые каркасы, которые полагались на циркуляцию среды, но им не хватало клеточного & #8209; выровненного просвета, необходимого для длительной & #8209; проходимости. Современные подходы непосредственно встраивают эндотелиализованные каналы в конструкцию во время изготовления.

Управление иммунным ответом

Аллогенные клетки, используемые в формировании сети, могут провоцировать иммунный отторжение. Даже аутологичные эндотелиальные клетки могут вызвать воспаление, если материал каркаса активирует врожденную иммунную систему. Биоматериалы должны быть разработаны для минимизации реакций инородного тела при содействии ангиогенеза. Покрытия с анти-8209; воспалительные молекулы или включение регуляторных Т-клеток являются новыми стратегиями для снижения отторжения и поддержки стабильности сосуда.

Передовые технологии для создания сетей

3D биопечать

Три‑мерная биопечать появилась как мощный инструмент для изготовления сосудистых сетей. Используя биоинки, состоящие из гидрогелей, живых клеток и факторов роста, исследователи могут печатать жертвенные каналы, которые позже заполняются эндотелиальными клетками. Один распространенный метод печатает беглые чернила, которые растворяются после того, как объемный гидрогель сшивается, оставляя после себя полые трубки. Эти трубки затем выстланы эндотелиальными клетками пуповинной вены человека (HUVECs) или индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками ‑производными эндотелиальными клетками. Недавние работы продемонстрировали печать разветвленных сетей диаметром до 100 мкм, хотя капиллярные & #8209; масштабные сосуды остаются сложными.

Коаксиальная биопечать использует сопло внутри сопла для экструдирования ядра‑насадки нити. Внутренний канал становится просветом; внешняя оболочка содержит гидрогель, нагруженный клетками гладкой мускулатуры или перицитами. Этот метод позволяет одновременно печатать эндотелий и поддерживающие клетки, производя сосуды с двуслойными стенками. Однако ограничения разрешения в настоящее время ограничивают коаксиальную печать сосудами диаметром >200 мкм. Исследователи объединяют биопечать с двумя‑фотонной полимеризацией для достижения суб‑10 мкм признаков, хотя пропускная способность остается низкой.

Микрофабрикация и микрофлюидика

Методы микрофабрикации, адаптированные из полупроводниковой промышленности, позволяют создавать точно управляемые сети каналов в кремниевых, стеклянных или полимерных формах. Мягкая литография с полидиметилсилоксаном (ПДМС) широко используется для изготовления микрожидкостных устройств с каналами до 1 мкм. Эти устройства отлично подходят для изучения потока и поведения клеток, но менее подходят для имплантации, поскольку ПДМС не является биоразлагаемым. Исследователи разработали методы передачи микроканальных узоров в гидрогели, такие как коллаген или фибрин, с использованием жертвенных шаблонов.

Заметным шагом вперед является использование растворимых сахарных или желатиновых волокон в качестве шаблонов. Волокна встраиваются в гидрогелевую матрицу и затем растворяются, оставляя взаимосвязанные каналы. Эндотелиальные клетки, засеянные в эти каналы, прилипают и образуют сливные накладки в течение нескольких дней. Этот метод позволяет создавать сложные трехмерные сети диаметром от 10 до 300 мкм. Путем объединения нескольких волокон можно создавать иерархические разветвляющиеся структуры, которые имитируют естественные сосудистые деревья. Однако процесс трудоемкий и трудоемкий для масштабирования до структур размером с орган‑.

Децеллюляризованные сосудистые леса

Альтернативой построению сетей с нуля является использование естественной сосудистой системы донорских органов. Децеллюляризация удаляет весь клеточный материал из органа животного или человека при сохранении внеклеточного матрикса, включая неповрежденное сосудистое дерево. Полученный каркас может быть затем повторно завернут с эндотелиальными клетками пациента‑производные эндотелиальные клетки. Этот подход был успешно применен к целым сердцам крыс, печени и почкам, которые впоследствии были перфузированы и показали ограниченную функцию. Основным преимуществом является сохранение родной архитектуры вплоть до капиллярного уровня. Проблемы включают обеспечение полного удаления клеток, чтобы избежать иммунных реакций и достижения равномерной рецеллюляризации всей сети.

Рецеллюляризация требует вливания эндотелиальных клеток (часто через основные сосуды) под контролируемым давлением и потоком. Клетки должны быть распределены по всем ветвям, включая самые маленькие капилляры, где сопротивление высокое. Несколько раундов перфузии с клеточными суспензиями, иногда в сочетании с магнитными или центробежными силами, улучшают покрытие. Даже тогда многие капилляры остаются пустыми или выстланы неполностью. Более того, многоклеточный эндотелий должен быть функциональным - экспрессирование молекул адгезии, регулирование проницаемости и реагирование на сдвигающий стресс. Недавние работы с использованием первичных синусоидальных эндотелиальных клеток печени показали лучшую удержание и функцию, чем HUVEC в децеллюляризированных печеночных каркасах.

Self‑Сборка и васкулогенез

При правильных условиях эндотелиальные клетки могут самостоятельно‑организоваться в капиллярные‑подобные сети посредством процесса, имитирующего васкулогенез. При встраивании в гидрогель с поддерживающими клетками, такими как фибробласты или мезенхимальные стволовые клетки, они прорастают, разветвляются и образуют люмен‑содержащие трубки. Этот метод дает физиологически релевантные капиллярные сети диаметром 5-15 мкм. Однако сети являются стохастическими и не имеют иерархической организации, необходимой для объемной перфузии. Для руководства само‑сборкой исследователи используют микропаттерны факторов роста или механические сигналы для направления прорастания. Комбинирование само‑сборки с предварительно‑сборной макроканальной сетью может создать гибридную систему, где крупные сосуды обеспечивают приток и отток, в то время как капилляры заполняют интерстициальное пространство.

Вживую имплантация таких самоорганизующихся сетей‑собранных сетей показала, что сосуды-хозяева вторгнутся и подключатся к сплетению в течение 1-2 недель. Эта техника в настоящее время используется для создания васкуляризированных кожных трансплантатов и заменителей костей. Но для целых органов медленная скорость иноскуляции и отсутствие контроля над топологией сети остаются основными барьерами.

Обеспечение интеграции с циркуляцией хоста

Даже самая идеально сконструированная микрососудистая сеть бесполезна, если она не может анастомозировать с кровоснабжением хозяина. Анастомоз возникает, когда эндотелиальные клетки имплантата и хозяина контактируют друг с другом, образуют межклеточные соединения и устанавливают непрерывный просвет. Этот процесс обусловлен ангиогенным прорастанием с обеих сторон. Исследования показывают, что анастомоз начинается в течение часов после имплантации и стабилизируется в течение 3-7 дней. Однако в толстых конструкциях ядро может оставаться неперфузированным дольше, что приводит к некрозу.

Несколько стратегий ускоряют интеграцию. Pre​ васкуляризация конструкции в биореакторе перед трансплантацией гарантирует, что сеть уже выстлана эндотелиальными клетками и может быть немедленно подключена к сосудам-хозяевам. Хирургические методы, такие как подключение основной артерии и вены имплантата к сосудистой системе хозяина (например, трансплантация), обеспечивают немедленную перфузию, но требуют, чтобы имплантат содержал по крайней мере один большой сосуд, который можно зашивать. Для небольших конструкций простое размещение имплантата вблизи сосудистого слоя стимулирует врастание; это используется во многих доклинических исследованиях.

Еще одна проблема заключается в предотвращении тромбоза. Световая поверхность сконструированных сосудов должна быть анти-8209; тромбогенной, экспрессирующей молекулы, такие как тромбомодулин и гепариновый сульфат. Покрытие каналов гепарином или посев с эндотелиальными клетками, которые продуцируют оксид азота, может уменьшить образование сгустка. Включение аналогов медленного & #8209; высвобождение простациклина или использование биоразлагаемых стентов, которые элюируют анти & #8209;коагулянты находятся под следствием.

Текущие успехи и оставшиеся трудности

В этой области были продемонстрированы доказательства и #8209; из & #8209; концепция в нескольких моделях мелких животных. Например, инженерные сердечные пластыри, содержащие перфузируемые микрососуды, были имплантированы в сердца крыс и показали, что они интегрируют и улучшают функцию после инфаркта миокарда. Аналогичным образом, васкуляризированные конструкции печени были имплантированы в качестве вспомогательных трансплантатов и поддерживали выживаемость гепатоцитов в течение нескольких недель. Однако, несколько исследований масштабировали эти подходы к крупным животным, таким как свиньи, и ни одно из них не достигло клинических испытаний на людях для замены органов.

Основными препятствиями являются масштаб и долговечность. Хотя возможно создать сосудистую сеть, которая поддерживает 1 см3-тканевой блок в культуре в течение нескольких дней, поддержание проходимости в течение нескольких месяцев в динамичной, текучей среде не было достигнуто. Эндотелиальные клетки могут дифференцироваться или становиться стареющими при постоянном напряжении сдвига, и фресочные клетки могут отсоединяться. Долгие & #8209; долгосрочные исследования с визуализацией (например, микро & #8209; КТ, две & #8209;фотонная микроскопия) необходимы для оценки ремоделирования сети и стабильности.

Еще одним ограничением является отсутствие лимфатической системы. В естественных тканях лимфатические капилляры сливают интерстициальную жидкость и предотвращают отек. Инженерные ткани, в которых отсутствует эта система, часто набухают, сжимая сосуды и нарушая поток. Некоторые группы в настоящее время работают над включением лимфангиогенных факторов или ко‑культуры лимфатических эндотелиальных клеток, но это остается в зачаточном состоянии.

Будущие направления

Умные биореакторы для созревания

Биореакторы, имитирующие гемодинамическую среду тела, имеют решающее значение для созревания инженерных микрососудистых сетей. Пульсатильное течение, циклическое растяжение и физиологический сдвиговый стресс (1-10 дина / см2) способствуют выравниванию эндотелия и регуляции механочувствительных генов. Биореакторы следующего поколения включают датчики для измерения кислорода, pH и сопротивления потоку в реальном времени, что позволяет обратную связь & #8209; контролируемое кондиционирование. Это может привести сеть к более нативному фенотипу перед имплантацией.

Персонализированная медицина и клеточные источники

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) предлагают пациенту & #8209; специфический источник клеток для построения сосудистых сетей. iPSC & #8209;производные эндотелиальные клетки и перициты могут быть расширены в больших количествах и генетически отредактированы для повышения стабильности или иммунной толерантности. Однако протоколы дифференциации должны быть улучшены для получения клеток, которые полностью повторяют специализированные фенотипы различных сосудистых кроватей (например, мозг против эндотелия печени). Использование пациентов & #8209;специфические клетки также устраняет необходимость иммуносупрессии, основного препятствия при трансплантации.

Organ‑on‑a‑Chip Integration

Микрососудистые сети являются неотъемлемой частью устройств для органов‑on‑a‑a‑чипов, которые моделируют физиологию человека для тестирования лекарств. Эти чипы объединяют микрофлюидные каналы с живыми клетками для воссоздания структуры и функции органов, таких как легкие, печень и почки. Включение перфузионной микроваскулатуры позволяет повторно использовать транспорт лекарств, метаболизм и токсичность в человеческом контексте. Достижения в этой области, вероятно, ускорят разработку васкуляризированных конструкций для терапевтического использования, поскольку уроки из чипов могут быть непосредственно применены к имплантируемым тканям.

Приложения вне трансплантации

Хотя конечной целью является производство органов, готовых к трансплантации, перфузионные микрососудистые сети уже имеют около 8209; терминальные применения в области открытия лекарств, токсикологии и моделирования заболеваний. Например, модели васкуляризированных опухолей позволяют исследователям изучать метастазы рака и тестировать анти-8209;ангиогенные методы лечения в контролируемой среде. Аналогичным образом, васкуляризированные модели печени могут предсказать метаболизм лекарств и гепатотоксичность более точно, чем 2D-культуры или модели на животных.

Эти платформы также позволяют исследовать сосудистые заболевания, такие как атеросклероз, диабетическая микроангиопатия и легочная гипертензия. Создавая сети с эндотелиальными клетками пациента & #8209, можно моделировать генетические предрасположенности и тестировать персонализированные методы лечения. Фармацевтическая промышленность все чаще принимает платформы для органов & #8209; на & #8209; a & #8209; чипы, чтобы уменьшить зависимость от тестирования на животных, и включение перфузионной микрососудистой системы рассматривается как необходимое для физиологической значимости.

Скрининг лекарств и тестирование на токсичность

В настоящее время многие препараты терпят неудачу в клинических испытаниях из-за неожиданной сосудистой токсичности или плохого распределения. Микрососудистые сетевые чипы позволяют реально‑время визуализации воздействия лекарств на целостность сосудов, перфузии и эндотелиальную функцию. Например, химиотерапевтические препараты, вызывающие синдром капиллярной утечки, могут быть проверены на таких платформах, идентифицируя соединения риска на‑раннее. Пропускная способность этих чипов увеличивается с автоматизацией и мультиплексированием, что делает их жизнеспособными для крупномасштабного‑масштабного скрининга.

Понимание ангиогенеза и развития

Инженерные микрососудистые сети также служат исследовательскими инструментами для изучения фундаментальной биологии. Точно контролируя градиенты факторов роста, жесткость матрицы и поток, ученые могут расчленять механизмы ангиогенного прорастания, созревания сосудов и регрессии. Эти идеи способствуют улучшению стратегий тканевой инженерии. Например, недавние работы показали, что перициты ощущают жесткость матрицы и регулируют их сократимость, что, в свою очередь, влияет на диаметр сосудов. Такие результаты информируют о конструкции каркасов с оптимальными механическими свойствами для формирования сети.

Заключение

Развитие перфузионных микрососудистых сетей в инженерных органах представляет собой один из самых захватывающих рубежей в регенеративной медицине. За последнее десятилетие достижения в области биопечати, микрофабрикации, децеллюляризации и клеточной самовосстановления & #8209; сборка приблизила нас к цели создания толстых, жизнеспособных тканей со встроенным & #8209; в кровоснабжении. Тем не менее, остаются значительные проблемы: достижение капиллярного & #8209; масштабное разрешение, обеспечение долгосрочной & #8209; стабильность, интеграция с циркуляцией хозяина без тромбоза и масштабирование на органы человека & #8209; масштабирование на междисциплинарные исследования, перспектива регулярного производства трансплантируемых, васкуляризированных органов становится все более ощутимой. В то же время, те же технологии уже трансформируют разработку лекарств и моделирование заболеваний, обеспечивая мощные платформы для изучения физиологии и патологии человека. Путь от доказательства & #8209; & #8209; концепция для клинической реальности потребует постоянных инвестиций, творчества и сотрудничества, но прогресс, достигнутый до сих пор предлагает четкий путь вперед.

Для дальнейшего чтения рассмотрим эти ресурсы: Национальные институты здравоохранения предоставляет обзор тканевой инженерии и регенеративной медицины ; всеобъемлющий обзор стратегий васкуляризации можно найти в Материалы обзоров природы ; подробности о 3D-биопечати сосудистых сетей обсуждаются в семинальной статье в науке ; и недавние достижения в области технологии орган‑on‑a‑чип выделены Wyss Institute.