Разработка сосудистой ткани мозга для моделей нейродегенеративных заболеваний

Последние достижения в области тканевой инженерии открыли новые возможности для изучения нейродегенеративных заболеваний, которые затрагивают миллионы людей во всем мире и для которых существует мало эффективных методов лечения. Одной из наиболее перспективных областей является разработка моделей васкуляризированной ткани мозга, которые имитируют сложную среду человеческого мозга. Эти модели интегрируют функциональные сети кровеносных сосудов с нейронными клетками, повторяя ключевые аспекты физиологии мозга, которых не хватает традиционным двумерным культурам и простым органоидам. Включая сосудистую систему, исследователи могут лучше исследовать, как кровоток, доставка питательных веществ и гематоэнцефалический барьер влияют на начало и прогрессирование заболевания. В этой статье исследуется важность васкуляризации, проблемы, с которыми сталкиваются, современные методы, приложения в исследованиях нейродегенерации и будущие направления для этой быстро развивающейся области.

Важность сосудообразования в моделях мозга

Васкуларизация относится к образованию сетей кровеносных сосудов в ткани. В мозге кровеносные сосуды имеют решающее значение для доставки кислорода и питательных веществ, удаления отходов и поддержания гематоэнцефалического барьера (ВВВ). Без надлежащей васкуляризации инженерные ткани мозга не могут полностью воспроизвести физиологические условия человеческого мозга. Мозг потребляет около 20% кислорода организма, несмотря на то, что составляет всего 2% его массы, что делает надежное сосудистое снабжение необходимым для выживания и функционирования нейронов. Кроме того, ВВВ, состоящий из эндотелиальных клеток, перицитов, астроцитов и базальной мембраны, избирательно контролирует прохождение молекул между кровью и паренхимой мозга. Этот барьер не только жизненно важен для гомеостаза, но также играет критическую роль в нейровоспалении и доставке лекарств. Не васкуляризированные модели часто страдают от некротических ядер из-за ограниченной диффузии, и они не в состоянии моделировать динамические взаимодействия между нейронными клетками и эндотелием, которые лежат в основе многих нейродегенеративных процессов.

При нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD) и боковой амиотрофический склероз (ALS), сосудистая дисфункция все чаще признается ранним и способствующим фактором. Например, снижение мозгового кровотока предшествует когнитивному снижению AD, а распад BBB позволяет нейротоксическим веществам проникать в мозг. Сосудистые модели позволяют ученым непосредственно наблюдать эти сосудистые вклады в нейродегенерацию, тестируя гипотезы, которые нельзя решить с помощью более простых систем. Кроме того, такие модели могут включать клетки, специфичные для пациента, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), предлагая персонализированную платформу для изучения генетических факторов риска и скрининговой терапии.

Проблемы в разработке сосудовидной ткани мозга

Создание в лаборатории васкуляризированной ткани мозга представляет собой несколько серьезных проблем. Преодоление этих препятствий требует инновационных подходов в биоинженерии, клеточной биологии и материаловедении.

Интеграция сетей кровеносных сосудов с нейронной тканью

Успешное объединение сосудистых и нервных компонентов — это не просто вопрос смешивания типов клеток. Два тканевых отсека должны быть организованы в три измерения с соответствующими пространственными соотношениями. Эндотелиальные клетки должны образовывать просветленные трубки, окруженные перицитами и базальной мембраной, в то время как нейроны, астроциты и микроглия занимают паренхиматозное пространство. Достижение этой архитектуры требует точного контроля над размещением клеток, композицией внеклеточного матрикса и сигнальными сигналами. Многие современные модели полагаются на самосборку, но полученные сосудистые сети часто разрежены, незрелы или функционально отключены от нейронного отсека.

Обеспечение стабильности и функциональности сосудистой системы

Даже при формировании кровеносных сосудов они могут не оставаться стабильными с течением времени. Эндотелиальные клетки могут дифференцироваться, сосуды могут регрессировать, а тонкий фенотип BBB может быть потерян. Инженерная сосудистая система должна быть перфузионной — способной поддерживать поток заменителя крови — доставлять кислород и питательные вещества по всей конструкции. Без потока сосуды разрушаются, и модель страдает от гипоксии. Достижение долгосрочной стабильности (> недели до месяцев) особенно сложно, поскольку требует непрерывной перфузии, соответствующего напряжения сдвига и поддержания зрелого фенотипа BBB. Многие группы теперь включают микрофлюидные каналы или биореакторы для обеспечения динамических условий потока.

Воспроизведение селективной проницаемости барьера кровяного мозга

BBB является не просто физическим барьером; это высоко регулируемый интерфейс со специализированными транспортерами, эффлюксными насосами и плотными соединениями. Воспроизведение этих особенностей в инженерной модели затруднено. Кокультура эндотелиальных клеток мозга с астроцитами и перицитами может вызывать некоторые барьерные свойства, но достижение значений трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER), сопоставимых с BBB in vivo (1500-2000 Ω·cm2), встречается редко. Кроме того, BBB проявляет региональную гетерогенность - например, циркуверикулярные органы имеют фенестратные капилляры. Модели должны быть адаптированы к конкретной области мозга, представляющей интерес для исследований нейродегенеративных заболеваний, поскольку патология часто начинается в определенных областях (например, нигра субстанции в PD, гиппокамп в AD).

Масштабирование ткани для практических применений

Большинство современных васкуляризованных моделей мозга представляют собой небольшие, миллиметровые конструкции. Масштабирование до клинически значимых размеров (сантиметров) при сохранении жизнеспособности и функции является основным препятствием. Большие ткани требуют иерархических сосудистых сетей, которые разветвляются от более крупных сосудов до капилляров, имитируя архитектуру реальных органов. Без такой иерархии ядро конструкции станет некротическим. Прогресс осуществляется с помощью 3D-биопечати и жертвенного формования для создания многомасштабных каналов, но воспроизводимое изготовление сложных сетей остается активной областью исследований. Кроме того, большие конструкции должны быть пронизаны кислородсодержащей средой, которая требует сложных систем биореакторов.

Методы и подходы

Исследователи изучают различные стратегии для преодоления этих проблем. Каждый подход имеет свои сильные стороны и ограничения, и часто несколько методов объединяются для создания более физиологически релевантных моделей.

3D биопечать

3D биопечать позволяет точно разместить клетки и биоматериалы в трех измерениях. Для васкуляризированных моделей мозга биоинки, содержащие нейронные клетки (нейроны, астроциты), печатаются вместе с биоинками, содержащими эндотелиальные клетки и перициты. Общая стратегия заключается в печати жертвенных нитей (например, желатин или плуронический F127), которые позже растворяются для создания полых каналов, которые затем засеиваются эндотелиальными клетками. Альтернативно, коаксиальная печать может производить прямо сосудоподобные структуры. Биопечать позволяет контролировать диаметр сосуда, угол ветвления и пространственную организацию. Недавние работы продемонстрировали биопечатные ткани мозга с перфузионной сосудистой структурой, которые остаются жизнеспособными в течение нескольких недель. Однако разрешение печати ограничивает капиллярное образование, и выбор биоинков, которые поддерживают как нейронные, так и сосудистые функции клеток, все еще оптимизируется. Ссылка: Обзор передовых материалов по биопечати для нервной ткани

Факторы роста и ангиогенные сигналы

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) является ключевым фактором формирования кровеносных сосудов. Многие протоколы включают VEGF, основной фактор роста фибробластов (bFGF) и ангиопоэтины в гидрогели или культуральные среды для содействия ангиогенезу. Однако простое добавление факторов роста может привести к неконтролируемым, протекающим сосудам. Исследователи разрабатывают пространственно-временно контролируемые системы доставки, такие как гепаринсвязывающие гидрогели или микрочастицы, которые выделяют факторы роста в ответ на клеточные сигналы. Некоторые группы используют генетическую модификацию эндотелиальных клеток для конститутивного экспрессирования ангиогенных факторов, хотя это вызывает опасения по поводу опухолевости. Цель состоит в достижении стабильной, зрелой сосудистой системы с функциональными свойствами BBB, что часто требует тщательного баланса про- и антиангиогенных сигналов.

Микрофлюидные устройства (Organ-on-a-Chip)

Микрофлюидные платформы создают микромасштабные каналы, имитирующие кровоток, позволяющие точно контролировать сдвигающий стресс, градиенты питательных веществ и удаление отходов. В типичном устройстве «мозг на чипе» центральный канал, выстланный эндотелиальными клетками мозга, отделен от соседних нейронных отсеков пористой мембраной. Перфузия через сосудистый канал создает динамическую среду, способствующую образованию ВВВ. Эти устройства отлично подходят для изучения барьерной функции, переноса лекарств и нейровоспалительных реакций. Однако они, как правило, 2D или квази-3D, ограничивая сложность архитектуры нейронных тканей. Последние достижения включают интеграцию 3D гидрогелевых отсеков и нескольких параллельных каналов для создания более реалистичных моделей. Ссылка: Nature Reviews Neuroscience на микрофлюидных моделях мозга.

Технология стволовых клеток

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) предлагают этически приемлемый и специфичный для пациента источник как нервных, так и сосудистых клеток. Сейчас существуют протоколы для дифференциации иПСК в эндотелиальные клетки мозга, перициты, астроциты и специфичные для региона нейроны. Эти клетки могут быть собраны в органоиды или специфичные для региона конструкции. Основным преимуществом является способность моделировать генетические формы нейродегенеративных заболеваний (например, мутации APP в AD, LRRK2 в PD) с использованием иПСК, полученных у пациентов. Недавние исследования генерировали васкуляризованные нейронные прогениторы с помощью кокультивации эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, или с помощью эмбриоидных тел, которые спонтанно подвергаются васкулогенезу. Однако эти органоиды часто не имеют перфузионных люменов и полагаются на диффузию, ограничивая их размер и продолжительность жизни. Расширенные протоколы теперь включают микрофлюидную перфузию во время органоидной культуры для содействия

Применение в исследованиях нейродегенеративных заболеваний

Модели сосудистой ткани мозга оказываются бесценными для изучения сложного взаимодействия между сосудистой дисфункцией и нейродегенерацией. Они обеспечивают контролируемую, относящуюся к человеку платформу для механистических исследований и тестирования лекарств, которые не могут быть достигнуты с помощью моделей животных или простой клеточной культуры.

Болезнь Альцгеймера

При болезни Альцгеймера церебральная амилоидная ангиопатия — накопление бета-амилоида в стенках сосудов — является отличительной чертой, связанной с распадом BBB и уменьшением мозгового кровотока. Васкуляризированные модели позволяют исследователям переназначить эту патологию, культивируя эндотелиальные клетки с нейронами, мутантными APP. Они могут изучать, как амилоидные бета-отложения повреждают BBB, вызывают потерю перицитов и вызывают нейровоспаление. Кроме того, эти модели позволяют тестировать препараты, предназначенные для восстановления целостности BBB или улучшения клиренса амилоида через барьер. Некоторые исследования использовали микрожидкие чипы, чтобы показать, что аполипопротеин E4 (APOE4), основной генетический фактор риска для AD, усугубляет дисфункцию BBB.

Болезнь Паркинсона

Болезнь Паркинсона характеризуется потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции. Область сильно васкуляризирована, а посмертные исследования выявляют сосудистые аномалии, такие как эндотелиальная дегенерация и пониженная плотность капилляров. Модели сосудистого среднего мозга можно построить, объединив дофаминергические нейроны, астроциты и эндотелиальные клетки, полученные из iPSC. Исследователи могут исследовать, как агрегаты альфа-синуклеина влияют на ВВВ и предшествует ли сосудистое нарушение потере нейронов. Эти модели также обеспечивают платформу для скрининга соединений, которые могут пересекать ВВВ для достижения пораженных нейронов.

Болезнь Хантингтона

Болезнь Хантингтона вызвана повторным расширением CAG в гене HTT. Пока в первую очередь считается нейронным расстройством, были задокументированы сосудистые изменения, в том числе повышенная проницаемость BBB и снижение мозгового кровотока. Мутант-охоттингтин экспрессируется в эндотелиальных клетках и перицитах, что предполагает прямое сосудистое участие. Инженерная васкуляризированная ткань мозга может помочь рассечь вклад сосудистых клеток в болезнь. Например, кокультуры мутантных и диких эндотелиальных клеток с нейронами могут выявить, усугубляет ли сосудистая дисфункция гибель нейронов. Такие модели также полезны для тестирования методов лечения, которые нацелены как на нервные, так и на сосудистые компоненты.

Тестирование лекарств и персонализированная медицина

Одно из наиболее практических применений — в разработке лекарств. Многие перспективные нейропротекторные соединения терпят неудачу в клинических испытаниях, поскольку они не пересекают BBB или потому что они имеют нецелевые сосудистые эффекты. Сосудистые модели мозга могут использоваться для оценки проницаемости BBB, скрининга нейротоксичности и оценки того, как препараты влияют на нейрососудистую связь. С iPSCs, полученными у пациента, эти модели предлагают персонализированную платформу для прогнозирования индивидуальных ответов на терапию. Например, пациенту с конкретным вариантом переносчика BBB может потребоваться другая доза или формулировка. Интеграция высокопроизводительных микрофлюидных препаратов и автоматизированной визуализации позволяет проводить скрининг сотен кандидатов на препараты на васкуляризированных чипах мозга.

Будущие направления

Область быстро развивается, но конечной целью остается разработка полностью функциональных, трансплантируемых васкуляризированных тканей мозга для регенеративной медицины.

Передовые материалы и биопечать

Гидрогели следующего поколения, имитирующие механические и биохимические свойства внеклеточного матрикса мозга (ЭКМ), улучшат выживаемость и дифференцировку клеток. Умные биоматериалы, которые выделяют факторы роста в ответ на ферментативную активность (например, матричные металлопротеиназы), могут динамически направлять ангиогенез. Многоматериальные биопринтеры, которые могут печатать градиентные структуры и включать жертвенные материалы, позволят создавать иерархические сосудистые деревья. Сочетание их с визуализацией в реальном времени и контролем обратной связи позволит самокорректировать изготовление.

Интеграция с микрофлюидами и датчиками

Будущие модели будут встраивать датчики для мониторинга уровня ТЭЭР, pH, кислорода и секреции цитокинов в режиме реального времени. Микрофлюидные системы замкнутого цикла будут регулировать скорость потока и состав питательных веществ на основе обратной связи с датчиками, поддерживая гомеостаз в течение нескольких месяцев. Такие платформы «орган-на-чипе» могут быть мультиплексированы для моделирования нескольких областей мозга, связанных сосудистой сетью, что позволяет проводить исследования о том, как распространяется патология (например, прионное распространение тау или альфа-синуклеина). Ссылка: Природная статья о многоорганном чипе для системных заболеваний .

Персонализированные и пациентоспецифические модели

По мере совершенствования технологии iPSC станет обычным получать васкуляризованную ткань мозга от каждого пациента для точной медицины. Сочетание этих моделей с редактированием генома (CRISPR) позволит коррекцию мутаций, связанных с заболеванием, и изучение генов модификатора. Биобанки васкуляризованных тканей мозга из различных генетических фонов помогут исследователям понять различия на уровне популяции в реакциях на лекарства и риске заболевания.

На пути к трансплантируемым тканям

Для пациентов с обширным повреждением мозга от инсульта или нейродегенеративного заболевания конечным терапевтическим видением является имплантация инженерной ткани, которая интегрируется с сосудистой системой хозяина. Доклинические исследования на грызунах показали, что преваскуляризированные нервные трансплантаты лучше выживают и способствуют функциональному восстановлению. Проблемы включают иммунный отторжение, соответствие области мозга пациента и достижение синаптической интеграции. Достижения в иммуносупрессии, иммунном маскировании и редактировании генов могут в конечном итоге преодолеть эти препятствия, что делает клинический перевод возможным в течение следующих двух десятилетий.

Заключение

Разработка моделей васкуляризированных тканей мозга является сложной, но важной задачей для продвижения нашего понимания и лечения нейродегенеративных заболеваний. Включая функциональные кровеносные сосуды и гематоэнцефалический барьер, эти модели фиксируют динамическое взаимодействие между нейронными и сосудистыми системами, которое является центральным для таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона. В то время как остаются значительные проблемы - от достижения стабильной функциональной сосудистой системы до расширения для скрининга лекарств - конвергенция биопечати, биологии стволовых клеток, микрофлюидики и материаловедения ускоряет прогресс. Продолжение междисциплинарных исследований не только улучшит моделирование заболеваний, но и проложит путь для персонализированной терапии и, в конечном счете, трансплантируемых тканей, которые могут восстановить функцию мозга. По мере созревания области эти инженерные ткани станут незаменимыми инструментами в борьбе с нейродегенеративными расстройствами, предлагая надежду миллионам пациентов во всем мире.