Разработка экономически эффективных альтернатив сыворотке крупного рогатого скота в клеточной культуре

Введение: Дилемма сыворотки в культуре клеток

На протяжении более полувека, плодовая бычья сыворотка (FBS) была золотой стандартной добавкой для клеточных культур. , полученная из крови бычьих плодов, FBS обеспечивает сложную смесь факторов роста, гормонов, связывающих белков и питательных веществ, которые поддерживают клеточную адгезию, пролиферацию и метаболизм. Его почти универсальная полезность сделала его незаменимым инструментом в фундаментальных исследованиях, биофармацевтическом производстве и регенеративной медицине. Тем не менее, те самые качества, которые делают FBS настолько мощным, также приводят к его наиболее насущным недостаткам: высокая стоимость, много-много изменчивости, этические проблемы по поводу благополучия животных и не ничтожный риск заражения патогеном.

Мировой рынок средств клеточной культуры оценивается в несколько миллиардов долларов, и только FBS составляет значительную часть этой стоимости. Один литр высококачественного FBS может варьироваться от 400 до 700 долларов или более, а в крупномасштабном производстве - таком как производство моноклональных антител или вирусных векторов - расходы могут стать основным узким местом. Кроме того, пакетная изменчивость означает, что различные партии FBS могут давать разные темпы роста клеток, морфологию или уровни экспрессии, что ставит под угрозу воспроизводимость и нормативное соответствие. С этической точки зрения сбор FBS включает в себя сердечную пункцию говяжьего плода и от финансирующих учреждений, которые теперь требуют альтернативных подходов. Наконец, риск введения в культивируемые клетки агентов (например, вирусная диарея крупного рогатого скота, микоплазма) подтолкнул отрасль к более определенным, более безопасным альтернативам.

Признавая эти проблемы, научное сообщество вложило значительные средства в разработку экономически эффективных, этически ответственных альтернатив, которые могут либо заменить, либо значительно сократить использование FBS. Эта статья предоставляет полный обзор наиболее перспективных заменителей, их преимуществ и ограничений, а также будущих направлений, которые, вероятно, будут формировать следующее поколение клеточных культуральных носителей.

Ключевые проблемы с сывороткой плода

1.Высокая и изменчивая стоимость

FBS является побочным продуктом мясной промышленности, и его предложение подвержено колебаниям в сельскохозяйственном производстве, вспышкам заболеваний и региональным правилам. В периоды дефицита цены могут резко расти, напрягая бюджеты исследований и производственные расходы. Для академических лабораторий, которые полагаются на FBS для рутинной культуры, расходы могут ограничить масштаб экспериментов. В коммерческом производстве стоимость одного только FBS может составлять до 30% от общей средней стоимости биологического препарата. Альтернативы, которые предлагают более низкую цену за литр или за дозу, поэтому очень привлекательны.

2.Переменная система «Бэтч-Бэтч»

Поскольку FBS является биологическим продуктом, каждый лот содержит уникальный состав белков, метаболитов и факторов роста. Эта изменчивость может привести к противоречивым экспериментальным результатам, затрудняя сравнение данных в исследованиях или удовлетворение строгих требований к воспроизводимости регулирующих органов. Например, партия FBS, которая поддерживает устойчивый рост конкретной клеточной линии, может не одинаково хорошо работать для другой линии или даже одной линии при другом проходе. Производители тестируют и сертифицируют каждый лот, но присущая сложность сыворотки означает, что нет двух одинаковых партий. Переход на химически определенную альтернативу без компонентов животного устраняет этот источник неопределенности.

3. Этические проблемы и благосостояние животных

Производство FBS предполагает забой беременных коров и извлечение крови плода. Процесс подвергся критике со стороны организаций по защите прав животных и регулирующих органов, в том числе рекомендация Европейской комиссии заменить сыворотку в культуре, где это возможно. Многие журналы теперь требуют от авторов обосновать использование FBS и изучить варианты без сыворотки. Финансирование агентств, таких как Национальный центр по замене, уточнению и сокращению животных в исследованиях (NC3Rs) в Великобритании, активно содействует развитию альтернативных препаратов, не относящихся к животным. Переход к определенным синтетическим добавкам соответствует широкому принципу 3Rs (замена, сокращение, рафинирование).

4.Риск загрязнения и иммуногенности

FBS может нести вирусы крупного рогатого скота, прионы, микоплазму и эндотоксины. Загрязнители могут не быть полностью удалены стандартной фильтрацией или облучением, и они представляют риск для клеточной терапии и биологических препаратов, предназначенных для использования человеком. Например, присутствие вируса бычьей вирусной диареи (BVDV) в FBS может мешать клеточному метаболизму и изменять экспериментальные результаты. Даже при тестировании низкоуровневое загрязнение может проскользнуть. Кроме того, компоненты животного происхождения могут вызывать иммунные реакции при использовании в клинических применениях, таких как вакцины или клеточная терапия, что требует строгой очистки или использования безжизненных сред с самого начала.

Эффективные альтернативные варианты FBS

Разработан широкий спектр альтернатив, каждая со своими сильными сторонами и оптимальными вариантами использования. Выбор замены зависит от типа ячейки, цели культуры (например, расширение против дифференциации) и нормативной среды. Ниже мы рассмотрим наиболее заметные варианты.

1. Лизат тромбоцитов человека (hPL)

Лизат тромбоцитов человека (hPL) производится из объединенных концентратов тромбоцитов человека, как правило, из донорской крови. Пластиноциты лизуются для высвобождения богатого коктейля факторов роста, цитокинов и хемокинов, которые имитируют естественную среду. hPL стал особенно популярным для расширения мезенхимальных стромальных клеток (MSCs), которые используются в клеточной терапии. Исследования показывают, что MSC, выращенные в добавляемых hPL средах, демонстрируют сопоставимые или превосходные скорости пролиферации и поддерживают свои иммуномодулирующие свойства и потенциал дифференциации.

Стоимость: Хотя hPL дороже стандартного FBS на литр, он часто превосходит FBS с точки зрения эффективности роста, а это означает, что необходимы более низкие концентрации. Кроме того, поскольку hPL получен от доноров-людей, он свободен от патогенов крупного рогатого скота и более этически приемлем. Однако hPL по-прежнему страдает от пакетной изменчивости (хотя и меньше, чем FBS) и несет теоретический риск передачи патогенов человека. Стандартизированные коммерчески доступные продукты hPL от таких компаний, как Thermo Fisher Scientific и Corning снизили изменчивость и повысили безопасность.

2. Сывороточные и химически определенные среды

Среда без сыворотки (SFM) не содержит сыворотки животного происхождения, но все еще может включать неопределенные компоненты, такие как гидролизаты. Химически определенные среды (CDM) полностью состоят из известных, очищенных ингредиентов (аминокислот, углеводов, витаминов, микроэлементов, рекомбинантных факторов роста, гормонов и липидов). Эти составы обеспечивают самый высокий уровень консистенции и воспроизводимости. Многие CDM также не содержат животных компонентов (ACF) и могут быть адаптированы к конкретным типам клеток.

Например, разработка CDM для клеток яичников китайского хомяка (CHO) была краеугольным камнем биофармацевтической промышленности, обеспечивая последовательную экспрессию моноклональных антител и других терапевтических белков. Аналогичным образом, определенные среды для эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), такие как mTeSR и StemFlex, заменили культуры фидерного слоя на основе FBS. Первоначальная стоимость CDM может быть выше, чем FBS, но улучшенный контроль процесса, снижение очистки вниз по течению и устранение изменчивости часто приводят к снижению общих производственных затрат.

3. растительные добавки и гидролизаты

Гидролизаты растительного происхождения, такие как соя, пшеничный глютен и дрожжевые экстракты, использовались в качестве экономически эффективных добавок для повышения роста клеток. Эти материалы богаты пептидами, аминокислотами и углеводами. Они, как правило, дешевле, чем FBS и не содержат компонентов животного происхождения. Однако их химическая сложность означает, что они не «определены», и вариации от лота к лоту все еще могут возникать. Современные методы обработки, такие как ферментативное пищеварение и фракционирование, улучшают консистенцию. Такие компании, как MilliporeSigma и IbioSource предлагают коммерческие растительные добавки, которые хорошо работают для определенных клеточных линий.

Комбинации гидролизатов растительного происхождения с рекомбинантными факторами роста часто могут достигать производительности, равной или лучше, чем FBS, за небольшую часть стоимости, особенно для крупномасштабных ферментаций бактерий, дрожжей или клеток насекомых, используемых для производства рекомбинантного белка.

4. Условные среды и паракринное обогащение

Условные среды собираются из культур поддерживающих типов клеток (например, слоев кормильца) или из самих клеток после периода роста. Они содержат секретируемые факторы — цитокины, внеклеточные пузырьки и метаболиты — которые могут способствовать росту других клеток. Этот подход часто используется в биологии стволовых клеток для поддержания плюрипотентности или для стимулирования дифференциации. Стоимость производства кондиционированных сред может быть ниже, чем покупка чистых факторов роста, но он все еще требует донорской культуры и может быть трудоемким. Исследователи все чаще обращаются к более определенным источникам соответствующих факторов для улучшения воспроизводимости.

5. Рекомбинантные факторы роста и синтетические альтернативы

Достижения в биотехнологии позволили производить рекомбинантные версии ключевых факторов роста, обнаруженных в FBS, таких как инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF) и трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β). Эти белки могут быть произведены в бактериальных, дрожжевых или млекопитающих системах и являются чрезвычайно чистыми. Они устраняют риск загрязнения крупного рогатого скота и позволяют точно формулировать среды. Стоимость рекомбинантных факторов резко упала за последнее десятилетие, что делает их жизнеспособными для рутинного использования. Например, комбинация рекомбинантного инсулина, трансферрина и селена (ITS) стала стандартной заменой роста-продвигающей активности сыворотки. Аналогично, рекомбинантный альбумин (например, CellPrimeTM рекомбинантный альбумин) может заменить альбумин бычьей сыворотки.

6. Беззеркальные адаптации классических формул

Многие классические носители, такие как DMEM, RPMI-1640 и MEM, предназначены для работы с FBS. Однако с добавлением специфических факторов роста и добавок они могут быть преобразованы в условия, свободные от сыворотки. Например, добавление DMEM с определенной липидной смесью, рекомбинантными белками и низкой концентрацией альбумина сыворотки человека может поддерживать многочисленные линейки клеток-прилипников. Этот подход снижает стоимость и изменчивость при использовании знакомства с существующими составами сыворотки. Исследователи часто постепенно адаптируют клетки от сывороточных содержащих к сыворотке свободных сред с использованием пошагового протокола для минимизации стресса.

Преимущества перехода на экономически эффективные альтернативы

Снижение прямых затрат

Наиболее непосредственная выгода является финансовой. Для лаборатории, которая использует 50 л клеточных культуральных носителей в год, переход от 10% FBS ($500/L) к химически определенному заменителю ($100/L) может сэкономить более 20 000 долларов в год. Крупномасштабные производственные мощности, работающие на тысячах литров, могут сэкономить миллионы долларов. Даже когда замена дороже на литр, более высокие темпы роста или выход продукта могут компенсировать стоимость. Например, MSC, выращенные в hPL, часто достигают целевых номеров ячеек быстрее, сокращая время культивирования и затраты на рабочую силу.

Улучшение воспроизводимости и нормативного соответствия

Химически определенные и не содержащие компонентов животного происхождения среды устраняют вариабельность от партии к партии, делая эксперименты более воспроизводимыми. Эта согласованность имеет решающее значение для нормативных представлений для клеточной терапии и биофармацевтических препаратов, где FDA и EMA требуют согласованных производственных процессов. Использование определенных носителей упрощает контроль качества и снижает риск неудачных партий. Руководство FLT:0 FDA по продуктам на основе клеток настоятельно поощряет использование материалов, не содержащих компонентов животного, когда это возможно.

Улучшенный этический профиль

Заменив FBS, исследователи выровняют свою работу с принципами 3Rs, улучшая этический статус своих исследований и повышая доверие общественности. Многие финансирующие органы теперь требуют от заявителей обосновать использование продуктов животного происхождения и рассмотреть альтернативы. Учреждения, которые принимают средства массовой информации без животных, также могут извлечь выгоду из позитивной прессы и права на конкретные гранты, ориентированные на этические инновации.

Снижение риска загрязнения и повышение безопасности

Устранение компонентов животного происхождения значительно снижает риск введения в клеточные линии авантюрных агентов. Для производства клинического класса это не обсуждаемое преимущество. Это также упрощает очистку вниз по течению, поскольку нет необходимости удалять белки крупного рогатого скота, которые могут быть иммуногенными у пациентов с человеком. Использование рекомбинантных факторов и синтетических добавок создает «чистый» исходный материал для любого терапевтического продукта.

Соображения в связи с осуществлением

Переход от ФБС к альтернативе требует тщательного планирования. Не все типы клеток легко адаптируются к условиям, не содержащим сыворотки. Некоторые клетки, особенно первичные или медленно растущие линии, могут потребовать постепенного перехода или гибридного подхода (снижение сыворотки пошагово при добавлении добавки). Исследователи должны рассмотреть:

Будущие направления в экономически эффективных клеточных культурах

Рекомбинантные коктейли без фактора роста животных

Достижения в области синтетической биологии позволяют производить сложные коктейли с фактором роста с меньшими затратами. Например, исследователи из нескольких учреждений разрабатывают рекомбинантные версии всего комплекса факторов роста, обнаруженных в FBS, смешанные в точных соотношениях, чтобы соответствовать или превышать производительность FBS. Некоторые из этих коктейлей в настоящее время выходят на рынок по конкурентоспособным ценам.

AI-Driven Media Design

Алгоритмы машинного обучения могут предсказать оптимальное сочетание питательных веществ и факторов роста для данной клеточной линии, резко сокращая экспериментальные усилия, необходимые для разработки новой среды. Такие компании, как Genomedica и академические группы использовали искусственный интеллект для разработки средств массовой информации, которые превосходят коммерческие формулы. Этот подход ускорит разработку экономически эффективных, специфических для клеток альтернатив.

Использование систем культуры клеток растений

Вместо того, чтобы использовать растительные гидролизаты в качестве добавок, некоторые лаборатории изучают культуру растительных клеток в качестве производственной платформы для факторов роста. Трансгенные растительные клетки можно выращивать в полностью синтетических средах для производства рекомбинантных белков по очень низкой цене, открывая новые возможности для доступных безжизненных медиа-добавок.

Персонализированные и пациентоспецифические СМИ

В производстве клеточной терапии (например, CAR-T-клетки, терапия, полученная из iPSC), использование сывороточных сред, адаптированных к собственным клеткам пациента, может повысить эффективность и безопасность. Аутологичный лизат тромбоцитов человека, приготовленный из собственной крови пациента, устраняет иммунные реакции и пакетную изменчивость, обеспечивая полный набор факторов роста. Несколько клинических испытаний изучают этот подход.

Интеграция с органо-на-чипе и 3D-культурой

По мере того, как область движется к более физиологически релевантным моделям 3D-культуры (например, сфероидам, органоидам), потребность в сывороточных средах становится еще более критической. Многие 3D-системы требуют точно контролируемых сигнальных сред, которые трудно достичь с помощью сложных сывороток. Определенные среды, которые поддерживают самоорганизацию и дифференцировку, уже используются для органоидов из тканей кишечника, печени, мозга и опухолей. Эти разработки обещают сократить использование животных в тестировании лекарств и базовой биологии.

Глобальная гармонизация и открытые источники информации

Возникающее движение выступает за открытые, полностью определенные медиа-формации, которые могут быть воспроизведены любой лабораторией. Путем обмена рецептами и данными проверки исследовательское сообщество может уменьшить дублирование усилий и снизить затраты. Примеры включают семейство носителей mTeSR для стволовых клеток, которые являются запатентованными, но вдохновили вариации с открытым исходным кодом. Инициатива Замена FBS в клеточной культуре обеспечивает протоколы и руководство для перехода на альтернативы.

Заключение

Переход от эмбриональной бычьей сыворотки больше не является отдаленной целью — это ускоряющаяся реальность. Движимые экономическим давлением, этическими императивами и нормативными требованиями, исследователи и производители принимают все более широкий спектр экономически эффективных альтернатив. От лизата тромбоцитов человека и химически определенных сред до растительных добавок и рекомбинантных факторов роста варианты более надежны и доступны, чем когда-либо прежде.

Хотя не существует единой замены «один размер подходит всем», прогресс в разработке медиа означает, что для почти любого типа клеток доступна или может быть разработана подходящая формула без FBS. Переход требует тщательной проверки, но вознаграждения - снижение затрат, улучшенная воспроизводимость, более высокая безопасность и более сильное этическое положение - существенны. Поскольку искусственный интеллект, синтетическая биология и открытая наука продолжают развиваться, ландшафт медиа культуры клеток станет только более сложным и экономичным, в конечном итоге принося пользу как исследованиям, так и пациентам, которые полагаются на биологические препараты и клеточную терапию, которые поступают из этих технологий.